骨髓细胞染色体制备

一、直接法

（一）试剂准备

1．PH7.4的PBS或0.9%的生理盐水20ml。

2．0.2%肝素。

3．0.0005%秋水仙酰胺溶液。

4．0.075mol/L KCL溶液

5．3:1甲醇、冰醋酸溶液。

6．10%Giemsa染色液。

（二）操作程序

1．标本采集。用肝素湿润的针筒抽取骨髓2ml或更多，立即注入含1640培养基的标本瓶中。

2．细胞接种。将标本瓶带回实验室后，先做骨髓有核细胞计数，再按8×10⁶/ml的细胞密度注入标本瓶中，然后补充PH为7.4的PBS或0.9%NS至20ml。

3．阻留中期分裂相。立即加入秋水仙酰胺，终浓度为0.05μg/ml，摇匀后置37℃温箱中1h。

4．收获细胞。将培养物吸至尖底离心管，离心，1000转/min，10min。

5．低渗。弃上清液，沿管壁缓缓加入预温37℃的0.075mol/L KCL溶液6～8ml，吹打混匀后置37℃温箱30min。

6．预固定。加入3:1甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混匀。

7．离心。1000转/min,10min。

8．固定。吸去上清液，加新鲜配制的3:1甲醇、冰醋酸固定液6～8ml，吹打混匀。

9.离心。1000转/min，10min。

10．重复9、10步骤两遍，使细胞经过3次固定，除第一次固定至少30min外，其余两次固定，每次15min或30min均可。

11．细胞悬液的制备和保存。吸去上清液，加入适量固定液，制成浓度合适的细胞悬液。此液置-20℃冰箱中可保存1至数年。在此期间可随时取出，供各种显带处理或FISH检测之用。

12．制片。用吸管将细胞悬液轻轻打匀后吸取少量，从10cm高处滴至一端倾斜15º的经冰水或20%乙醇浸泡过的洁净无脂的玻片上，每片滴2～3滴，然后在酒精灯上焰上来回通过数次，使其干燥。

13．染色。标本采用10% Giemsa染色液染色20～30min，流水冲洗，待干，镜检。剩余标本置4℃冰箱或-20℃冰箱备做各种显带之用。

（三）注意事项

1．骨髓直接法应在标本采集后1h内进行，超过此时间则细胞活力下降而致分裂相少见。

2．骨髓直接法的效果好坏与细胞接种关系不大，因此若不准备进行培养者，骨髓抽吸后可立即注入20ml生理盐水中，而不需要作骨髓有核细胞计数。

3．骨髓细胞染色体制备和外周血染色体制备最主要的不同在于：①秋水仙酰胺终浓度和处理时间：前者0.05μg/ml×1h，后者0.1μg/ml×2～4h；②低渗时间；前者30min，后者15min。

二、短期培养法

（一）试剂准备

1．培养基的配制和保存。同外周血染色体制备[第二部分第五章一]。

（二）操作程序

1．细胞接种。将标本瓶带回实验室后，先做骨髓有核细胞计数，再按1～3×10⁶/ml的细胞密度注入标本瓶中，然后补充PH为7.4的PBS或0.9%NS至20ml。

2．细胞培养。将培养瓶放入37℃温箱中持续培养24或48h，其间定时摇匀培养物。

3．阻留中期分裂相。于终止培养前2-4h加入秋水仙酰胺，终浓度为0.1µg/ml。

4．收获细胞。将培养物吸至尖底离心管，离心，1000转/min，10min。

5．低渗。吸去上清液，加入预温至37℃的0.075mol/L KCL溶液6～8ml，用吸管吹打混匀后置37℃温箱15min。

6．预固定。加入3:1甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混匀。

7．离心。1000转/min,10min。

8．固定。吸去上清液，加新鲜配制的3:1甲醇、冰醋酸固定液6～8ml，吹打混匀。

9.离心。1000转/min，10min。

10．重复9、10步骤两遍，使细胞经过3次固定，除第一次固定至少30min外，其余两次固定，每次15min或30min均可。

11．细胞悬液的制备和保存。吸去上清液，加入适量固定液，制成浓度合适的细胞悬液。此液置-20℃冰箱中可保存1至数年。在此期间可随时取出，供各种显带处理或FISH检测之用。

12．制片。用吸管将细胞悬液轻轻打匀后吸取少量，从10cm高处滴至一端倾斜15º的经冰水或20%乙醇浸泡过的洁净无脂的玻片上，每片滴2～3滴，然后在酒精灯上焰上来回通过数次，使其干燥。

13．染色。标本采用10% Giemsa染色液染色20～30min，流水冲洗，待干，镜检。剩余标本置4℃冰箱或-20℃冰箱备做各种显带之用。

（三）注意事项

1．细胞密度以1～2×10⁶/ml左右为宜。

2．远距离运送的标本必须在24h内投入培养。

3． 改良方法有以下两种，可任择其一：①收获细胞前6h加入10^-5mol/L的胸腺嘧啶核苷（Tdr），秋水仙酰胺处理时间缩短为10～30min；②收获细胞前2h加入终浓度为10μg/ml的溴乙锭，秋水仙酰胺处理时间不变。