|  举例说明：成软骨诱导步骤（三维诱导）

（以下步骤仅供参考，详情参见参见说明书）

1. 间充质干细胞的准备:

将对数生长期的细胞消化下来计数，取3×105个细胞转移到15mL离心管中，250g离心4min。

弃上清，加入0.5mL成软骨诱导分化培养基基础液，重悬细胞，150g离心5min。小心弃去上清，加入0.5mL成软骨诱导分化培养基诱导液，重悬细胞，150g离心5min。

将15mL离心管的管盖稍稍旋开，放置于37℃，5% CO2培养环境下培养。

2. 细胞分化诱导:

24h后观察细胞沉淀形变团聚的情况，如有明显的变化，则小心轻柔地拨动管底，尝试让细胞团脱离管底，全部浸润在诱导液中。

置于37℃，5%CO2培养环境下培养约21天，通常每2天更换一次新鲜配制的成软骨诱导分化培养基诱导液。注意观察细胞团成球情况及表面光滑度，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

3. 染色鉴定

a)软骨球固定：将软骨球从离心管中转移至EP管，并使用1×PBS清洗两次，最后置于适量的4%中性甲醛溶液中。

b)石蜡包埋切片：软骨球经石蜡包埋后切片。

c)阿利辛蓝染色：将石蜡切片脱蜡，使用阿利辛蓝染液染色30min，用自来水流水冲洗2min，蒸馏水冲洗1次。

d)诱导评估：显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。

NOTE: 间充质干细胞的成软骨分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。

|  举例说明：成软骨诱导步骤（平面诱导）

（以下步骤仅供参考，详情参见参见说明书）

1. 将对数生长期的细胞消化下来计数，成软骨诱导分化培养基细胞重悬细胞，离心后调整细胞密度密度1-2.0×107cells/mL。

2. 20μL悬滴到24孔板中央。（20μL含有4×105细胞）。

37℃培养3h使细胞贴壁。

3. 补充200uL诱导分化培养基正常培养，每隔2-3天换液一次。按照以上换液频率诱导21-28天，并注意观察细胞形态变化。

4. 细胞固定：吸去培养基使用适量1×PBS清洗一次，弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30-60min，弃去固定液再使用1×PBS清洗两次。

5. 阿利新蓝染色：向清洗干净的诱导孔内加入适量染色液，避光静置染色30min。吸去阿利新蓝染色液，用1×PBS清洗两次，并加入适量1×PBS避免细胞干燥。

6. 诱导评估：显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。

NOTE:间充质干细胞的成软骨分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。

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