Small RNA测序

简介：

小RNA是广泛存在于植物、动物、细菌和真菌中的一类非编码RNA的统称，它们长度不等，但大都在20个核苷酸左右。1993年，维克托·安博斯在线虫幼虫发育调控研究中发现了小RNA，引发了科学家对小RNA的关注；越来越多的小RNA包括siRNA等在不同物种中被纷纷发现与鉴定，同时也掀起了分析小RNA功能的研究热潮。

小RNA序列短，一般为20-28nt，并且同源程度高，经常为3’单碱基差异，成为小RNA检测的瓶颈；传统的Sanger测序法操作复杂，花费大，测序深度有限，效率较低，因此在很大程度上制约了植物小分子RNA 的发现速度。自2005 年以来，人们开始采用以大规模平行标签测序技术（massively parallel signature sequencing，MPSS）、454-FLX（454 life sciences）和Solexa（illumina）测序技术为代表的新型焦磷酸高通量测序技术（pyrosequencing）来发掘植物小分子RNA。这些第2 代测序技术尽管获得的序列较短，但具有速度快、成本低、覆盖度深、产出巨大等优点，因此非常适合小分子RNA 测序，尤其是对那些拷贝数低的小分子RNA。新一代测序技术的发展为小RNA高通量检测打开了大门。

高通量测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列, 高度同源), 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度, 使得数据“不浪费”, 同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA. 在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑猩猩中都已经成功地找到了新的小分子RNA. 在线虫中获得了40万个序列, 通过分析发现了18个新的小RNA分子和一类全新的小分子RNA, 通过对人胚胎干细胞发育前后的分析, 获得了334个小RNA的表达谱带, 包括新发现的104个小RNA.

近几年利用高通量测序技术挖掘植物小分子RNA 的研究成果，以期反映高通量测序技术在加速植物小分子RNA发现、促进植物小分子RNA 功能研究以及提高人们对植物小分子RNA 进化的认识等方面的最新进展。如Sunkar 等人^[1]为了获得水稻应答盐和干旱胁迫相关的小分子RNA，采用454-FLX 法对来自盐和干旱处理条件下生长四周的水稻幼苗的小分子RNA 进行了深度测序。在所获得的3.3×105 个小分子RNA 序列中，作者不仅发现了已知的46 个水稻miRNA 家族，同时还获得了23 个新的低拷贝miRNA和40 个候选miRNA。Subramanian 等人^[2]对经慢生大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）侵染3 h 后的大豆根的小分子RNA 文库进行测序分析之后，获得了3.5×105 个小分子RNA序列。他们发现的小分子RNA 涵盖了50%以上的大豆miRNA，其中miR159 在慢生根瘤菌侵染大豆3 h后表达量急剧上升，表明它可能参与了大豆对该菌侵染过程的应答。杨树是目前植物中第3 个具有全基因组序列的物种。

Small RNA（miRNA，ncRNA，siRNA，snoRNA，piRNA，rasiRNA等）是生命活动重要的调控因子，几乎存在于所有的生物体中。Small RNA通过多种途径（包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成等），在生物体基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等过程中发挥着重要作用。Illumina Solexa测序技术能够通过强大的高通量测序方法鉴定并定量出任何物种组织或者细胞中的全部Small RNA图谱，从而发现新的microRNA分子，为其功能研究奠定基础。

参考文献：

 [1] Sunkar R Z X, Zheng Y, Zhang W, Zhu J K. Identification of novel and candidate miRNAs in rice by high throughput sequencing. BMC Plant Biology, 2008, 8: 25.

[2] Subramanian S F Y, Sunkar R, Barbazuk W B, Zhu J K, Yu O. Novel and nodulation-regulated microRNAs in soybean roots. BMC

Genomics, 2008, 9: 160.

技术路线：

1. small RNA分离；

2.文库构建： 连接接头，RT-PCR扩增，文库纯化和检测；

3. DNA在Cluster Station成簇扩增；

4. GAIIx测序仪直接测序；

5. 生物信息学分析。

生物信息学分析：

²  基本数据分析：长度分布统计、基因组分布等

²  分类鉴定：miRNA, siRNA和piRNA和其他

²  Small RNA注释

²  新的miRNA预测

²  miRNA表达模式分析

²  共有和特有Small RNA分析

²  miRNA的表达模式聚类分析

²  miRNA靶基因预测

²  已知miRNA的家族分析

样品要求：

1.样品纯度要求： OD值应在1.8至2.2之间；电泳检测28S:18S至少大于1.5。

2.样品浓度： total RNA浓度不低于750ng/ul；样品总量不低于40ug（Small RNA: total RNA大于0.3%）。或提供浓度大于2ng/ul，总量大于180ng的Small RNA样品。

3.请提供Small RNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。请同时附上QC数据，包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。如需进行多次样品制备，需要提供多次样品制备所需样品。

应用文献：

1、Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, Sewer A, Iovino N, et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell. 2007;129:1401–1414.

霍华德·休斯医学研究所联合29家单位对miRNA进行的基础研究。从人类和啮齿类动物26个不同器官和细胞类型构建了250个小RNA文库，并通过测序鉴定miRNAs。此研究为miRNA的成熟序列、前体、染色体定位、成熟过程、转录单元和保守模式提供了详细的和精确的信息，并提出了一套辅助miRNAs进一步实验和计算功能分析的分类方案。

2、Morin,R.D. et al. Application of massively parallel sequencing to microRNA profiling and discovery in human embryonic stem cells. Genome Res. 2008; 18: 610–621.

加拿大温哥华卑诗省癌症署基因组科学中心和Terry Fox 实验室报道了一种利用Illumina测序技术研究小RNA的新方法。提出了一套从已知的miRNA注释序列，辨别成熟miRNA序列变异，并确定序列属于以前未知TUNEology 波长可调检测卡盒-->