动物品种

SD大鼠、小鼠、家兔、猴

动物性别

雌雄

动物周龄

一般为成年动物

造模方法

A.  液氮冻伤皮肤动物模型

（1）  动物适应性饲养7天，将动物随机分为对照组、模型组（每组中雌雄数量一致）。对所有动物背部或耳部区域剃毛处理，剃毛区域为直径 2～4 cm的圆形。将银元或铁棒等浸入液氮罐中15 min左右，使其充分冷却至-196℃，取出之后立即将其贴紧大鼠（小鼠、家兔）皮肤造模部位一定时间（具体时间根据实验目的确定），可选择不同时间（常规参见冻伤时间）造不同程度的冻伤模型，如轻度冻伤(Ⅰ度和Ⅱ度冻伤又称为浅层冻伤)、重度冻伤(Ⅲ度和Ⅳ度冻伤又称为深层冻伤)。

a.  冻伤时间：家兔模型：贴皮肤时间3～8 s(轻度)、 (10～15 s)重度。大鼠模型：贴皮肤时间3～5 s(轻度)、 5～15 s(重度)。小鼠：2～4 s(轻度)、 5～8 s(重度)。

b.  冻伤面积：不同动物冻伤面积，小鼠以直径10 mm左右为宜，大鼠以直径20 mm左右为宜，家兔以直径40 mm为宜。皮肤局部冻伤后，制备模型成功。

注意事项：应控制好冷冻时间、冻伤面积及程度和冷冻源，减少个体差异。轻度冻伤于冻伤后第5～6 天自愈，重度冻伤至少能够维持10 d。

B.  直接冻伤胫前肌制备大鼠冻伤模型

模型建立：动物适应性饲养7天，将动物随机分为对照组、模型组（每组中雌雄数量一致）。将大鼠麻醉之后在无菌条件下分别游离双侧胫前肌 (保留起止点)，术中尽量不要损伤肌膜。用接触面积约1. 0 cm × 1. 8 cm的矩形金属条(厚2. 5 cm)经液氮冷冻后，直接放压在胫前肌表面90 s，冻后接触部位的肌组织苍白变硬， 约5 ～ 6 min逐渐由白转为暗红色，用无菌冲洗液冲洗，直接缝合皮肤，制备胫前肌深度冻伤模型。

注意事项：减少冻伤局部深度等的差异，防止造模过程的感染

C.  低温乙醇浸泡法制备冻伤模型

模型建立：动物适应性饲养7天，将动物随机分为对照组、模型组（每组中雌雄数量一致）。将模型组家兔(大鼠、小鼠、猴)足脱毛，暴露表皮，用无刺激软头记号笔在动物足体外侧缘骨凸起处上涂记号线，作为浸冻线。将足浸入低温90%乙醇或低温95% 乙醇中，可根据不同动物，选择不同的造模方法。

a.  小鼠模型:于-20 ℃ ，95%乙醇中浸泡，轻度冻伤1min左右，重度冻伤3 min左右。

b.  大鼠模型:于-25 ℃ ， 90%乙醇中浸泡，轻度冻伤1～5 min，重度冻伤时间7～ 10 min。

c.  兔模型：Ⅰ～Ⅲ度冻伤浸泡(-10 ℃ ， 95%乙醇)时间分别为 8， 10， 15 min，Ⅳ 度冻伤在-20 ℃ 中浸冻，当足组织温度降至-5 ℃ (自浸冻线中点上方插入针状热电偶感应)时再继续浸冻10 min；浸冻后在25℃室温下自然复温，用无菌纱布包扎。冷冻后即制备成冻伤模型。

D.  模拟高原低氧复合冷冻法制备大鼠冻伤模型（有条件可做）

模型建立：动物适应性饲养7天，将动物随机分为对照组、模型组（每组中雌雄数量一致）。将模型组大鼠置于大型复合低压舱内以进行缺氧习服训 练，上、下午各 30 min。模拟低压缺氧环境设备由小型真空 干燥箱改造而成。习服训练时，调节进气阀使舱内压恒定于47. 2 kPa，模拟海拔6 000 m高度，设定温度(25 ± 1)℃ ，相对 湿度 40% 。习服1周后，将大鼠麻醉后，背部脱毛露出皮肤， 形成直径(30 ± 2) mm 的圆形裸露皮肤，将液氮渗透器底部圆形铝合金接头与大鼠背部脱毛部位皮肤紧密贴合，进行液 氮渗透冷冻，温度-196 ℃ ，冷冻时间10 s，形成重度高原冻伤模型。该模型至少维持20 d。

注意事项：应注意舱内环境恒定不变，保证所制备模型的稳定，减少个体差异。

成模鉴定

外观指标：冻伤动物模型制备成功后，Ⅰ度冻伤：①充血或水肿；皮肤初为苍白色，渐转为红色;②无水疱形成;③皮肤发热、干 燥，皮温高;④皮肤出现红肿、烧灼、疼痛和刺痒感。Ⅱ度冻伤：①充血和水肿：②有水疱形成，水疱液为浆液性或淡血性；③水疱基地呈鲜红色且潮湿，皮温较高；④全层皮肤冻伤，局部皮肤红肿，发痒，触痛觉敏感，疼痛明显。Ⅲ度冻伤：①出血性水疱和水肿，水疱液为血性、暗红色，伤后 2 周变为 黑色焦痂，结痂剥脱后，露出肉芽组织；②皮肤全厚度坏死； ③水疱基底呈紫红或暗红，皮温低下，呈青蓝色；④水疱和坏死皮肤干化后形成黑硬干痂皮，厚而硬，触痛觉迟钝。Ⅳ度 冻伤：①水疱液为血性，呈暗红色、咖啡色或深紫色，体积较小，重者可无水疱；②冻肢皮肤全厚度均坏死；③皮肤苍白、 青灰色或紫蓝色；④皮肤触痛觉消失或明显迟钝;⑤肢体剧烈疼痛。

冻伤区域皮肤取材染色：其中轻度冻伤(Ⅰ～Ⅱ度) :主要损伤皮肤、肌肉，早期表皮结构完整，真皮下有轻度水肿，有少量淋巴细胞浸润，偶见有灶性出血；后期表皮有部分坏死，水肿稍有加重，有白细胞浸润，表皮结构基本完整。

重度冻伤(Ⅲ～Ⅳ度) ：主要损伤肌肉和骨，表皮下有水泡，水肿明显，血管扩张充血，胶原成分增多， 毛囊皱缩，有较多的白细胞浸润；后期表皮及附属器结构模糊，水肿明显，真皮血管扩张出血，血管壁亦有坏死改变，有大量的炎细胞浸润。

造模周期

3周

后续检测指标建议

a.  病理检测：对冻伤皮肤组织进行HE染色，镜检冻伤模型局部的病理观察，表皮结构坏死及水肿，淋巴细胞浸润，偶见灶性出血，毛囊皱缩等。

b.  皮肤存活面积:冻区存活面积与冻区总面积的百分比。

备注