1. 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光 PCR 仪进行实时荧光检测。

2. 内含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。

3. 特异性比 RT-PCR 高，因为 RT-LAMP 扩增使用 4-6 条引物而不是两条。

4. 灵敏性可达 10 拷贝/反应以下（随引物而不同），故假阴性率更低。

只可用于科研，只可进行定性检测，不能用于定量检测。

低温运输，-20℃保存，保存期限为一年

RT-LAMP 模板及 RT-LAMP 引物、PCR 级石蜡油（仅对使用金属浴或水浴者）。

准备工作：如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动前打开并调到 60-65℃。如果用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。金属浴和水浴温控远远不如PCR 仪器，所以使用前需要用阳性对照和阴性对照（水）做预实验确认可用。一、样品 RNA 的制备

1. 用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数 RNA 提取试剂盒兼容。

2. 如果有 N 个样品，则至少需要做 N+2 个样品制备，包括一个制备阳性对照（制备时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，一起经历提取过程）和一个制备阴性对照（用水替代样品）。最后 N+2 个样品一起进行 RNA 提取操作，得到 N+2 个 RNA 样品。

二、合成 1st-strand cDNA

按下表配制 RT 反应体系:

4. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。

5. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可改成 45℃保温 5 分钟。

6. 加入 1μL (=200 U) MMLV 逆转录酶（含 RI），终体积为 20μL。

7. 42℃保温 60 分钟。

8. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作为

LAMP 模板使用，不需要纯化。

三、 荧光及可视化 LAMP 扩增及检测（20μL 体系）

9. 反应设置：如果有 N+2 个 cDNA 样品，则最好设置 N+4 个LAMP 扩增，增加 LAMP

阴性对照和 LAMP 阳性对照各 1 个。在 N+4 个 0.2mL PCR 管中加入下列成分：

10. 混匀后进行扩增。由于本产品含双染料，可以根据实验室条件选择下列三种方式进行扩增和检测。

11. 如果使用PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，则必须先在每个反应管中加 30 μL 自备的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率（如果使用 PCR 仪器并开启热盖，则可以不加石蜡油）。60-65℃保温 90 分钟，肉眼观察管内液体颜色。

12。如果使用荧光定量 PCR 仪：设为 60-65℃保温 1 分钟/循环， 90 个循环，每分

钟在 FAM 通道采集一次荧光信号。

13. 如果使用PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，再使用 qPCR 仪进行终点法荧光读数： 则在扩增前和扩增后，分别在 qPCR 仪器上测荧光读数（温度设为 60-65℃，1 次循环，每次循环 1 分钟，在 FAM 通道采集一次荧光信号。注意：测荧光读数必须在 65℃进行）。扩增反应按 60-65℃，90 分钟进行。

四、 结果分析及解读

14. 如果是用普通PCR 仪器、水浴或金属浴进行的扩增，反应结束后只能肉眼判断结果。将反应管放置在白色背景（如白纸）TUNEology 波长可调检测卡盒-->