Charm-Pure ™ 唾液 gDNA 提纯试剂盒（离心柱法）

室温保存，Proteinase K 和 RNase A 保存在 4 ºC。

试剂盒组成及贮存

      Charm-Pure ™ 唾液 DNA 提纯试剂盒可从 Charm-Protect 唾液收集和储存液中提纯 gDNA，其组成如下表所示。所有 的组分除了 Proteinase K 和 RNase A 需要保存在 4 ºC 之外，其余组分室温保存即可。可进行 50、250 或者 5 次 gDNA 的提纯。

产品介绍 ：

      Charm-Pure™ 唾液 gDNA 提纯试剂盒专为从 Charm-Protect 唾液收集和保存瓶的唾液保存液中分离提纯高质量的 唾液 gDNA 而设计，操作步骤简单迅速。Charm-Pure™ 提纯系统离心柱（Spin-Column）采用改进的硅膜来选择性地 吸附核酸，较常规的硅膜更加高效地提纯高纯度的唾液 gDNA。抽提缓冲液中的 DNA 分子可特异性地与改进后的 硅膜相结合，而蛋白和其它污染物不被结合而保留在溶液中透过硅膜。用 Washing buffer 来清洗离心柱（SpinColumn），去除未结合的物质，提纯的 gDNA 可用 Elution Buffer（EB2）或水来洗脱。提纯的 gDNA 直接可用于下 游反应如限制性酶切反应、SNP 分析、PCR、序列分析、全基因组扩增（WGA）和 DNA 甲基化分析等。

所需的额外材料

• 无水乙醇

• 异丙醇

• 1.5 ml 或 2.0 ml 离心管

• 唾液收集和保存瓶中的 Charm-Protect 唾液 DNA 保存液 

• 移液器和吸头

• 可离 1.5 ml 或 2 ml 离心管的离心机

• 涡旋振荡器

• 水浴锅或恒温金属浴

常规防范 

1. 该试剂盒仅用于实验。

2. 实验操作时穿实验服，戴一次性手套。避免摄取和吸入试剂，避免与试剂盒中试剂进行皮肤接触，一旦接触， 用手彻底冲洗。

3. 提纯核酸 DNA 时，使用无菌新吸头避免污染。 

实验之前准备

1. CT-236-M 试剂盒，加 22 ml 无水乙醇到 Washing Buffer I（WB1）中，充分混匀。CT-236-L 试剂盒，加 110 ml 无水乙醇到 Washing Buffer I （WB1），充分混匀。CT-236-S 试剂盒，加 2.2 ml 无水乙醇到 Washing Buffer I （WB1），充分混匀。注意在瓶上做好标记表示已加乙醇！– 室温保存，加了乙醇的 WB1 在六个月之内使用。

2. CT-236-M 试剂盒，加 44 ml 无水乙醇到 Washing Buffer II（WB2）中，充分混匀。CT-236-L 试剂盒，加 220 ml 无水乙醇到 Washing Buffer II（WB2），充分混匀。CT-236-S 试剂盒，加 4.4 ml 无水乙醇到 Washing Buffer II （WB2），充分混匀。注意在瓶上做好标记表示已加乙醇！– 室温保存，加了乙醇的 WB2 在六个月之内使用。

3. 该试剂盒可从 100 µl - 1200 µl 唾液保存液中提纯 gDNA。

4. 在进行 gDNA 提纯实验之前，为了避免 gDNA 降解，请遵守标准的 Charm-Protect 唾液 DNA 保存液收集和保存 程序。

操作指南

制备裂解液 

以下步骤适用于从 300 µl 唾液保存液中提纯 gDNA。若需从 600 µl 唾液保存液中提纯 gDNA，请来电咨询详细步 骤。

1. 加 10 µl RNase A（RA2）到一个 1.5 ml 或 2.0 ml 的离心管中。

2. 将储存在 Charm-Protect 唾液收集瓶中的唾液样品与唾液保存液来回颠倒和震荡 7 - 8 次后静置 3 - 5 分钟。

3. 从唾液收集瓶中吸取 300 µl 唾液保存混合液到加了 RNase A（RA2）的离心管中，吹打溶液 8 - 9 次或盖上盖子 后颠倒离心管 7 - 8 次，混合均匀（当吸取唾液混合液时，注意不要吸到收集瓶底颗粒状沉淀，如食物颗 粒。）。

4. 加 10 µl Proteinase K（PK2）到唾液混合液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管 15 - 18 次，充分混匀。

5. 将离心管置于 62 ºC 水浴锅或金属浴中温育 45-60 分钟，期间颠倒混合离心管。如果愿意，也可置于 52 ºC 温育 过夜。  

结合 DNA 

1. 向上述唾液混合液中加 150 µl Binding Buffer（GB3）和 200 µl 异丙醇，来回吹打溶液 8 - 9 次，混合均匀。

2. 将所得的唾液混合液（约 670 µl）转移到含有收集管（Collection Tube）的离心柱（Spin-Column）中，室温下 8000 rpm（RCF = 5800 g）离心 1 分钟。

3. 取出 Spin-Column，将收集管中的滤液予以丢弃，将 Spin-Column 重新插入到收集管中。

清洗 DNA 

1. 向 Spin-Column 中加 500 µl 含有乙醇的 Wash Buffer I（WB1）。

2. 将带有收集管的 Spin-Column 以最大转速（≥ 13000 rpm 或 16000 g）室温离心 1 分钟， 倒掉收集管中滤液。

3. 向 Spin-Column 中加 500 µl 含有乙醇的 Wash Buffer II（WB2）。

4. 将 Spin-Column 以最大转速（≥ 13000 rpm 或 16000 g）室温离心 1 分钟，倒掉收集管中滤液。

5. 重复步骤 3 和 4，即用 Wash Buffer II（WB2）洗两次。

6. 以最大转速将带有收集管的 Spin-Column 离心1 分钟来彻底去除含有乙醇的 Wash Buffer。丢掉收集管。将 SpinColumn 放入干净的 1.5 ml 离心管中。（在转移 Spin-Column 时，注意避免残留的 Wash buffer 接触到 SpinColumn 的尖端。） 

gDNA 的洗脱

1. 取一定体积的 Elution Buffer（EB2）到 1.5 ml 离心管中，置于 72 °C 金属浴或水浴中加热。

2. 向 Spin-Column 的膜中央，加 50 µl 预热的 Elution Buffer（EB2），室温下至少静置 1 分钟。

3. 室温下最大速度离心 1 分钟，1.5 ml 离心管中的滤液即为纯化的 gDNA。注意：如果有需要，可用 50 µl Elution Buffer（EB2）进行再次洗脱。这一步可增加产量 15 - 30 %，但提纯的 gDNA 因为体积增大，终浓度会降低。

4. 洗脱到离心管中的 gDNA 可直接用于下游反应，或者置于 4 ºC 短期保存或 - 20 ºC 长期保存。 

电泳及下游的应用 

提纯的 gDNA 可用琼脂糖凝胶电泳进行质检。可用分光光度计或荧光标记法或其它定量方法来测量产量。建议取 5-8 µl 提纯的 DNA 进行电泳检测。纯化的 gDNA 可直接用于下游反应，如限制性酶切反应、引物延伸、SNP 分析、 PCR、STR 分析、DNA 序列分析、全基因组扩增（WGA）及其它分子实验操作。

常见问题及解决方案

DNA 产量低：起始材料质量差。 裂解不彻底。 样品本身量不同（统计发现，每个人的唾 液 DNA 含量是不同的，小孩 DNA 量少， 老年人 DNA 量多）

解决方案： 确保严格遵守手册推荐的样品收集和保存程序。 62 ºC 温育时间延长 15-30 分钟。 增加提纯时唾液使用量，用 600 µl - 1200 µl 唾液 保存液来提纯 gDNA，请来电咨询详细步骤。

PCR 没有产物 ，原因：PCR 反应液中漏加组分

解决方案：确保加了所有的组分。核对 PCR 反应的阳性对照 和阴性对照。