高分辨率熔解曲线(HRM)

    高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新方法。基本原理是基于核酸分子由于片段长短、 GC 含量、GC 分布及单个碱基差异等物理性质不同而造成DNA 分子在加热变性时都会有不同的熔解曲线的形状和位置，并配合运用高浓度的饱和荧光染料，可以迅速的检测出核酸片段中GC含量和单碱基的突变。

技术优势

• 高通量：1次可同时检测10-384样本。
• 高敏度：HRM检测灵敏度达1%-0.1%，是传统“PCR+测序”方法25-250倍。
• 特异性好：PCR产物无需后续处理，特异性达100%。
• 重复性好：用HRM方法进行分析时，样品经PCR扩增后直接进行HRM，PCR产物无需再转入其它分析装置，而直接在同一个PCR管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。
• 操作简便：只需设计PCR引物，进行PCR反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，在Roche LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器上直接获得高分辨率熔解曲线分析，即可完成对样品基因型的判断。
• 成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且拓展了其应用面。

由于上述优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。其中，主要的研究方向集中在：

• 基因未知突变以及 SNP 的扫描；
• 已知突变及 SNP 的基因分型；
• 动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定；
• 法医鉴定、亲子鉴定；
• HLA 的配型；
• 甲基化的研究等。

技术平台

  近年来，公司引进了Roche LightCycler® 480 II 和ABI VIIA7 全自动荧光定量PCR系统，由从事多年HRM研究专家配套专业的HRM 分析软件，开辟了自己独特的研究策略和方法，为客户打造专业化HRM服务。

服务内容

1 外显子突变位点筛查

   1.1 实验过程：外显子引物设计（300bp以内）→上机预实验（确定引物特异性，无非特异性扩增）→正式实验→HRM分析→差异样品外显子测序。

   1.2 提供结果：完整实验报告（包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等）。

   1.3 实验实例：对182个病例的PIK3CA 基因第20外显子进行筛查，筛出2个有突变病例。

2 已知SNP位点检测

   2.1 实验过程：SNP引物设计（200bp以内）→PCR预实验（确定引物特异性，无非特异性扩增）→正式上机实验→HRM分析→不同基因型测序验证。

   2.2 提供结果：完整实验报告（包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等）。

   2.3 实验实例：对53个病例的rs7193343位点进行HRM检测，分析出不同的3种基因型。

3 Cold-PCR & HRM检测低水平基因突变体

    3.1 技术简介：

   许多癌症的发生与体细胞中低水平的DNA突变的发生相关，如低水平FMR1基因型与乳腺癌和卵巢癌相关联；低水平的BRAFV600E突变基因与直肠癌发生关联。这些基因如果在胚胎发育过程中发生完全突变可能是致命性的，只有只有那些携带低水平基因突变型的胚胎才能够存活下来。所以癌症体细胞中基因分子层面的突变，常常需要在大量野生型DNA中辨识低浓度的DNA突变。但是，突变检测方法的选择率和灵敏度常常限制了鉴定低浓度突变的可靠性。COLD-PCR解决了低含量基因突变检测的一些局限性，在PCR扩增过程中利用关键变性温度来提高含有突变的扩增子丰度，以便于在PCR后的可以直接测序检测到基因低水平的突变。然而碱基测序仍然是昂贵的选择，从而通过高通量扫描序列预检是有吸引力的办法。高分辨率融解（HRM）是一种可用于预筛查测序之前未知突变的技术，但不能确定具体的检测基因突变的身份。因此，为了富集、快速筛查和鉴定低浓度的未知突变，我们把HRM突变扫描和COLD-PCR相结合，随后进行已知突变的直接测序鉴定，大大提高了检测效率。

    3.2 实验过程：引物设计（300bp以内）→PCR预实验（确定引物特异性，无非特异性扩增）→正式上机Cold-PCR实验→HRM分析→突变型测序验证。

    3.3 提供结果：完整实验报告（包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等）。

     3.4 实验图例：

4 甲基化状态检测

    4.1实验过程：待测基因序列片段或位点甲基化引物设计（200bp以内）→ 利用甲基化转移酶修饰的DNA和非甲基化修饰的DNA制备标准品（100％和0％CpG甲基化）→ 上机预实验（一般制作0％，1％，5％，10％，20％，50％，100％梯度 HRM标准曲线）→ 正式实验（亚硫酸氢盐处理样品DNA→PCR→HRM分析→克隆测序验证）→ 实验报告。

    4.2 提供结果：完整实验报告（包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等）。

    4.3 实验实例：对2个病例的某基因20个CG位点进行检测，分析出不同的甲基化程度。

服务说明

①样品要求：

  ﹡血液样品：样品为EDTA抗凝或枸椽酸钠抗凝，样品量大于0.5 ml，样品采集后于-20℃或-80℃保存，低温（≤-4℃）运输。

  ﹡组织样品：样品可以为新鲜组织（最好-80℃保存）或石蜡包埋的组织，也可以是95%乙醇中固定的组织，组织量大于100 mg。

  ﹡ DNA样品：纯度OD260/280 比值为 1.8-1.9，浓度≥20ng/ul，体积≥20ul。