荧光定量PCR服务

　　一般而言，荧光PCR扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和

平台期 。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在明显线性关系，我们选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值 ，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，在本实验中荧光阈值是通过软件自动优化选择的。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数。因此只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
　　在实验操作中，取样都是以体积或重量为单位的，但是同样体积或重量的样本所来源的细胞数目并不一样，所以拷贝/μL或拷贝/ng的定量数据相互之间实际上并不可比。只有将这些数据归一到以拷贝/细胞或拷贝/基因组为单位后，才可进行严格意义上的比较。 这种校正可以通过适当的IPC（阳性内对照Internal Positive Control）来完成，IPC一般选用beta-actin、GAPDH、rRNA等管家基因。由于它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境因素影响较小，其定量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量。校正方法为： [DNA]样本/ [DNA]IPC。
　　我们采用标准曲线法进行相对定量实验。在此方法中，目的基因的量是相对于某个样本的量而言的，所以对该样本进行梯度稀释，制作出标准曲线。其他样本的量都来自于标准曲线，通过IPC校正后，再除以该样本的量就可以得到目的基因的相对定量结果。
　　我们采用的检测方法是SYBR(R) Green I嵌合荧光法或TaqMan TM探针法。

【服务项目】
● 绝对定量：利用已知浓度标准品制作标准曲线，根据标准曲线来确定样本中目的基因的拷贝数或浓度。
● 相对定量：指某一个样本中目的基因相对于另一参照样品的量的变化。即参照样品是1的样品，其它的样品为参照样品量的N倍。
● Affymatrix表达谱芯片结果验证：采用相对定量的方法对基因表达数据结果进行验证。

【服务项目】
● 绝对定量：利用已知浓度标准品制作标准曲线，根据标准曲线来确定样本中目的基因的拷贝数或浓度。
● 相对定量：指某一个样本中目的基因相对于另一参照样品的量的变化。即参照样品是1的样品，其它的样品为参照样品量的N倍。
● Affymatrix表达谱芯片结果验证：采用相对定量的方法对基因表达数据结果进行验证。

【服务流程】
● 样本cDNA的制备，包括样本RNA的提取、纯化、检测、逆转录等
● 引物设计合成
● PCR条件摸索
　　使用设计合成的引物，以客户提供样本的cDNA为模板，进行Real Time PCR反应，确认引物模板的反应性能。改变退火温度和Mg2+浓度等以达到最佳PCR反应条件。
● Real Time PCR反应及定量分析
　　对客户提供的样本进行Real Time PCR反应，并定量分析。选取一个样本进行3个浓度梯度稀释，每个浓度梯度做3管重复，制作标准曲线，根据标准曲线计算出其他样本的相对量。用相对定量方法进行定量分析时，要对管家基因等IPC基因进行同样操作，用所得到的值进行RNA量的校正，最后求得目的基因的相对表达量。

【服务价格】

【说明】
● 以上服务报价是针对采用SYBR(R) Green I 嵌合荧光法的报价。如果采用TaqMan探针方法时，具体价格请垂询。
● 以上服务是针对相对定量服务的报价，如需要进行绝对定量服务，需另收标准品制备费用。
● 以上服务报价为一个目的基因的报价。同样的样本做N个基因的检测，其价格为一个目的基因价格的N倍.
● 进行mRNA表达量分析，如果提供的total RNA量少或目的基因表达量低，Total RNA不能作为标准品使用时，需要制备体外转录的RNA标准品，此时制备标准品费用另收。
● 如因实验材料等非本公司原因造成某实验步骤失败，使实验提前终止，已启动的实验项目仍正常收费。

【注意事项】
● 请认真填写Real Time PCR服务委托合同，明确基因和样本的详细信息。
● 进行mRNA表达量分析时，请寄送足量并且保证纯度的Total RNA（浓度在100ng/μl以上，体积在20μl以上)。如果目的基因表达量低时，应尽量提供更高浓度的Total RNA.
● 如果提供的材料为细胞或组织，DNA、RNA的提取纯化费用另收。同时应保证材料新鲜，细胞数为106以上，动物组织为5mg以上。