环境微生物多样性检测

宏基因组学（Metagenomics）也称为元基因组学，是以样品中的微生物群落作为整体进行研究的学科。自然界中约有99%的微生物是不能在实验室条件下进行纯化培养的。宏基因组学研究不要求对每个微生物进行分离纯化培养，而是直接从样品中提取基因组DNA后进行测序分析。通过宏基因组测序，能够解释微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性及环境之间的相互协作关系，极大地扩展了微生物学研究范围。

一、    技术路线

推荐平台： Roche 454 FLX+、Illumina MiSeq

二、生物信息分析

1.    原始数据整理、过滤及质量评估

2.    OTU列表生成及注释

3.    基于物种丰度分析：

l  稀释曲线

l  Alpha多样性分析

l  物种丰度差异分析

l  聚类分析（热图）

l  多元统计分析（根据实验设计）

4.    基于群落结构分析：

l  单样品物种分布

l  多样品物种分布

l  含进化关系的物种分布

l  Beta多样性分析（PCoA、NMDS）

5.    根据客户需求进行个性化分析

三、    样品要求

1.       样品采集：由于环境条件的变化对微生物影响很大，因此要求样品采集条件保持高度一致。为了防止微生物死亡或DNA降解，采样后立即冷冻保存。

2.       样品DNA：环境因素异常复杂，许多物质或抑制因子会影响后续PCR、测序文库构建和序列测定，常规提取方法不一定合适，建议按公司要求采用专用试剂盒提取。基因组DNA浓度＞50 ng/μl，总量＞500 ng，OD 260/280在1.8-2.0之间，并确保电泳检测无明显RNA条带，基因组条带清晰、完整；基因组DNA完全无降解；提供DNA电泳检测照片，用自封袋密封后随样品一起送样。

3.       样品保存期间切忌反复冻融。

4.       送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。

四、经典案例

案例1：人类“肠型”的研究

背景：人体肠道微生物与人类健康息息相关，是否能以这些微生物的多样性来划分不同的肠型是一个值得探讨的问题。

目的：利用Illumina和Roche 454测序平台对不同年龄、体重、性别及国籍的人群肠道微生物多样性进行研究。

结果：研究发现人体胃肠道微生物区系并不是随机组合而成的，在所有受检人群中大致可以分为三种类型（enterotypes）：拟杆菌型（Bacteroides）、普氏菌型（Prevotella）、瘤胃球菌型（Ruminococcus）。对更大规模的人群（154名美国人和85名丹麦人）进行调查也得到了同样的结论，这说明在人体的肠道内真正存活较好的微生物生态组，其数量可能并不太多。不过这种分型方法和人体的年龄、体重、性别或国籍都没有任何关联。

[ Arumugam M, Raes J, Pelletier E, et al. Enterotypes of the human gut microbiome. Nature, 2011, 473(7346): 174-180 ]

案例2：北极多年海冰和表层海水微生物多样性研究

背景：北极多年海冰（multiyear ice，MYI）的急剧减少表明这种环境可能在100年后就会消失，为了了解这种微生物多样性丧失的影响，对北极附近的两处多年海冰的微生物群落进行研究。

目的：利用Roche 454 FLX测序平台对2个多年海冰和3个海水样本中的微生物16S rDNA的V3区进行测序，揭示出北极多年海冰和表层海水的微生物群落结构。

结果：北极多年海冰与周围的海水中微生物存在很大的差异。其中，多年海冰中的微生物群落多样性与海水相当，但是丰度较少。此外，还首次在北极海冰中发现蓝藻以及一些过去未曾报道的低丰度微生物物种。

[ Bowman JS, Rasmussen S, Blom N, et al. Microbial community structure of Arctic multiyear sea ice and surface seawater by 454 sequencing of the 16S RNA gene. The ISME journal, 2012, 6(1): 11-20 ]

五、常见问题解答

1.  Q：哪些环境样品可以进行微生物多样性检测？

A：针对宿主相关样品如皮肤、口腔、呼吸道、消化道、生殖道等进行研究；针对环境相关样品，如土壤、水体、空气、盐湖、沼泽等进行研究。

2.  Q：基于高通量测序的环境微生物多样性检测技术有何优势？

   A：常规的宏基因组学研究方法包括基因克隆文库、变性梯度凝胶电泳DGGE/TGGE等，但这些方法的通病是信息量太小，不能充分反映复杂的环境微生物多样性和分布。

基因克隆文库构建和检测的工作量大，且自然界中99%的微生物在实验室都没有办法纯化培养，从培养基上挑取克隆菌株，摇菌转化测序，效率低下。DGGE法曾经广泛应用于检测微生物群落结构的多态性，但是需要标准菌株，且受到凝胶电泳特性的局限，无法检测到稀有菌群的种类，因此其重复性和分辨率都不甚理想。

第二代高通量测序无需构建质粒克隆文库，这避免了文库构建过程中利用宿主菌对样品进行克隆而引起的系统偏差，可以直接对环境样品中的基因组片段进行测序，简化了基本操作，提高了测序效率，它能够对一个群落中微生物的多样性作更加深入和全面的描述，且具有通量高，重复性好，精确度高的优点，因而在微生物生态学研究中逐渐占据了优势。

3.    Q：人体为什么又叫“超级生物体”？

A：1958年的诺贝尔生理及医学奖得主Joshua Lederberg提出了“超级生物体”（Superorganism）”的概念，是指人体由真核细胞与体内共生的微生物共同组成。研究发现正常人体肠道中存在约1000-1500种微生物，重量达到1-1.5 kg。微生物数量是人体细胞总数的10倍，微生物基因数量是人类基因数量的100多倍。

4.    Q：派森诺生物可针对微生物的哪些高变区进行测序分析？

A：采用Roche 454 FLX+平台，可实现对细菌16S rDNA的V1-V3或者V4-V6的三个高变区以及对真菌ITS全长进行测序；采用Illumina MiSeq平台，可对细菌V3/V4的单V区、V5-V6实现双V区测序；同时可以实现对古菌V5~V6双V区进行测序。