转运RNA (tRNA) 是生物体内分布最广泛、含量最丰富的非编码小RNA分子。它携带并转运氨基酸，参与蛋白翻译，是连接mRNA与蛋白质的重要桥梁。细胞增殖、分化和凋亡等一系列生物学过程都伴随着tRNA水平的变化。反之，tRNA表达谱的改变也会影响细胞发育过程中的命运抉择。表达失调的tRNA可以促进肿瘤的发生和癌症进程。另外，许多其它疾病比如II型糖尿病、亨廷顿症以及HIV感染都出现了tRNA表达与分布紊乱。tRNA研究已逐渐成为生物学过程和疾病研究的重要组成部分。
   美国Arraystar公司是非编码RNA研究最优秀的产品服务提供商。近期Arraystar发布了市场上首款专注于tRNA研究的PCR芯片­— nrStar™ Human tRNA Repertoire PCR Array。该款芯片可同时检测66个细胞核tRNA和22线粒体tRNA，覆盖了tRNA权威数据库GtRNAdb和tRNAdb中的所有反密码子，方便客户快速地进行tRNA表达谱分析，为下一步的密码子偏好性、蛋白翻译效率和准确性、细胞动力学以及病毒感染的细胞嗜性等研究提供重要线索，是进行tRNA研究必不可少的工具。为了保证数据可信度，芯片还包含了3个看家小RNA作为内参，3个质控对照RNA Spike-in、PCR阳性对照（PPC）和基因组DNA对照（GDC）,分别用于监测cDNA合成质量、PCR效率和基因组DNA污染。
   tRNA存在种类繁多的修饰，对其发挥功能十分关键。然而，这些修饰尤其是甲基化修饰会严重阻碍反转录的进行，导致cDNA合成终止或碱基错配。为此，Arraystar专门开发了针对tRNA的反转录试剂盒 (rtStar™ tRNA-optimized First-Strand Synthesis Kit)。该试剂盒采用了一种高效的RNA去甲基化酶AlkB，能够有效地去除tRNA上的甲基化修饰，极大地提高cDNA合成质量。与此试剂盒组合使用，研究人员能够获得更为真实可靠的tRNA表达变化，为研究蛋白质组或tRNA来源片段（tRFs）提供重要信息。

nrStar™ Human tRNA Repertoire PCR 芯片产品列表

芯片特点
• 囊括GtRNAdb和tRNAdb数据库中所有的细胞核与线粒体反密码子
• 伴随的去甲基化处理使得检测结果更加真实可靠
• 所有引物均在多种细胞和组织中通过验证
• 即拆即用型384孔板，几小时内便可得到结果

康成tRNA Repertoire PCR芯片服务实验流程
1. RNA抽提与质量检测
    进行RNA常规抽提，使用NanoDrop ND-1000检测RNA浓度和纯度，使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。详细的样品QC结果见Arraystar服务报告。
2. 去甲基化处理与cDNA合成
    每样本取1.5 μg RNA，使用rtStar™ tRNA-optimized First-Strand Synthesis Kit (Cat# AS-FS-004, Arraystar) 试剂盒进行去甲基化处理和反转,合成cDNA第一链。详细步骤参照Arraystar产品操作手册。
3. Real-time PCR扩增
    将cDNA与 Arraystar SYBR Green qPCR Master Mix (Cat# AS-MR-005-5, Arraystar)混合，加入至384孔板中，在ABI 7900 PCR仪上进行Real-time PCR扩增。
4. 熔解曲线分析与原始数据导出
    PCR扩增完成后，进行熔解曲线分析，使用PCR仪自带软件导出原始数据。出具Raw Data文件夹，包含原始Ct值、PCR扩增曲线图和熔解曲线图。

康成tRNA Repertoire PCR芯片服务数据分析流程
1. PCR芯片数据质控
    质控参数：Ct(Blank)>35; Ct(GDC)>35; Ct(RNA Spike-in)<25; Ct (PPC) <25. 符合上述条件的样本进入下一步分析。数据QC结果见Arraystar服务报告。
2. 数据校正与△Ct值计算
    板间校正：使用Ct(PPC)对不同PCR板进行板间校正。
    内参校正与△Ct值计算：挑选最优内参，使用内参均值计算△Ct值。
3. 差异倍数计算 (2^(-△△Ct))
    使用 △△Ct 方法计算不同样品组之间的表达差异倍数。
4. P值计算
    对样本组进行t检验，计算P值。
5. 其他常规数据分析
    散点图分析；火山图分析；TOP20表达上调和下调tRNA柱形图分析
6. 提供服务报告与数据分析结果
   a. Arraystar服务报告（包括RNA样本QC、qPCR数据QC和详细实验数据分析步骤）
   b. Excel芯片结果汇总表（包括tRNA列表，数据分析结果和各类图表）
   c. Raw Data文件夹 (包含原始数据、扩增曲线图和熔解曲线图)

康成tRNA Repertoire PCR芯片服务部分数据分析结果展示
1. 差异表达tRNA列表（默认筛选参数：差异倍数>1.5；P<0.05，客户可指定筛选参数值）

2. 散点图 (黑色斜线代表差异倍数为1，红色斜线代表差异倍数为1.5)

3. 火山图（黑色垂线代表差异倍数为1；粉色垂线代表上调或下调倍数为1.5；蓝色水平线代表P值为0.05）         

4. TOP20表达上调tRNA柱状图

5. TOP20表达下调tRNA柱状图

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