介绍

荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR 反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件对产物进行分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模版的量。实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃，运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。

检测分类

1. mRNA表达量水平检测：相对定量法。
2. MicroRNA表达量水平检测：通过设计特殊茎环结构的反转录引物，结合实时定量PCR可以精确检测微量样品中microRNA表达水平。内参基因一般用U6。
3. 基因拷贝数检测：如检测样品中不同细菌含量、基因工程菌目的基因拷贝数、环境中耐药基因检测等。采用绝对定量法。

定量方式

1. 绝对定量：用已知浓度的标准品绘制标准曲线，而后通过标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量（起始拷贝数）分析。
2. 相对定量：以内参基因为参照，比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化，通常用来对mRNA表达量进行分析。一般采用2－ΔΔ Ct 法进行计算。每个样本重复三次。

检测方式

1. SYBR Green Ⅰ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

2. TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

样品要求

■ 须提供新鲜的足量材料（细胞数106个以上，组织100 mg以上），样品-70℃快递至本公司（干冰或液氮运送，以保证样品质量），亦可提供保证质量的DNA或RNA样品（2 μg以上）；

■ 提供靶基因信息，包括基因序列或GenBank Accession Number等；

■ 提供详细的背景资料，生物物种信息（Human、Mouse、Rat等）、DNA/RNA来源、基因丰度等。

提供结果

引物和探针及序列，胶图，原始数据（包括扩增曲线和熔解曲线）、数据分析结果及实验报告。

检测周期