肽库的两种构建途径
产品名称: 肽库的两种构建途径
英文名称: 肽库的两种构建途径
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肽库(peptide library)
肽库是大量某一长度(如六肽)的短肽的集合,它包括了该长度的短肽的各种可能序列或其中的尽大部分,是近几年发展起来的一种技术。肽库的构建有两种途径:一种是有机合成法,一种是基因工程法。
(1) 有机合成法就是直接利用固相肽多肽合成技术,合成含有各种可能序列的短肽。通过这种合成可以保证各种序列的多肽等机率出现。每个载体上只含有一种序列的短肽,其优点是构建方法简单,迅速。缺点是不能扩增,筛选比较麻烦,需进行荧光标记或ELISA,在显微镜下操纵工作量比较大。在研究构象性表位时的minotopes方法即采用类似的方法。通常从二肽开始合成并逐渐增加肽链长度及置换氨基酸种类,直至达到与抗体的最大结合为止。
(2) 基因工程法 该法先利用基因克隆技术将合成的一组寡核苷酸混合物(小肽基因混合物)克隆至线性噬菌体基因组中,使之以融合蛋白的形式在噬菌体的外壳蛋白的氨基端表达。再利用生物素或酶标记的抗体筛出特异的噬菌体,并进行扩增,再筛选,从结合特异抗体的噬菌体DNA序列推断出氨基酸序列,并合成相应的短肽,验证筛选结果。在构建的过程中用到的载体系统来源于丝状噬菌体的两个外壳蛋白基因PⅢ和PⅤ。图1为PIII载体构建示意图。在每个融合蛋白中各有一个氨基酸序列的可变区。这一区域的氨基酸组成决定于随机合成的简并密码子NNK或NNM(N代表A,T,G,C;K代表G,T;M代表A,C)。由NNK或NNM代表的32种密码子可指导合玉成部20种氨基酸,且包含一个终止密码子UAG。
Fig 1 Construction of the epitope library
这种由基因工程方法构建的噬菌体库又称为表位文库。表位文库构建的成功与否,噬菌体克隆的数目是一个决定因素。以随机六聚体氨基酸为例,10亿种左右(326)的DNA序列编码大约6400万种(206)的氨基酸序列。因此要使所有可能的氨基酸序列都包含在文库中,至少需要10亿个独立的克隆才行。考虑到密码子的简并性,一般2亿~3亿个独立克隆的表位文库就能顺利地进行下一步的筛选。用此法检测的抗原表位有人H铁蛋白、蓝舌病病毒的外壳蛋白VP5等。
肽库技术还存在一些需要改善的地方。首先,目前所建的肽库只能达到109,构建大片断的肽库很困难。其次,肽的多样性题目。第三,少数肽或者由于过于疏水,或者由于影响外膜蛋白的折叠而不能在噬菌体外正确表达。作为一种新技术,类似的具体题目还很多。http://www.ontoresinc.com/ 但这些暂时的缺点并不能掩盖它的巨大应用潜力。