人Oct-4基因干扰慢病毒有效靶点验证实验

摘要：本实验使用qPCR和Western Blot实验验证4个针对人Oct-4基因干扰慢病毒的干扰效果。实验结果表明与阴性对照比较PY1002慢病毒的干扰效率在mRNA和蛋白水平分别达到90%和80%以上。
关键词：RNAi，Oct-4，qPCR，Western Blot

一、 实验原理
由于基因转录后的mRNA高级结构的存在以及序列SNP位点，mRNA翻译效率等诸多因素的影响，设计的RNA干扰靶点最终在蛋白水平的干扰效果也不尽相同。使用qPCR以及Western Blot对RNA干扰靶点的效果进行检测可以获得有效的干扰靶点，为后续的基因功能提供实验基础。

二、 实验目的
使用qPCR以及Western Blot对RNA干扰靶点的效果进行检测以获得有效的干扰靶点，为后续的基因功能提供实验基础。

三、 实验步骤
1. 准备细胞：
1) 细胞铺板：
将PANC-1细胞按30%的融合度接种到6孔板：
a) PANC-1细胞配成4×105 cells/ml细胞悬液，待铺板。
b) 每孔铺2×105 cells/well，铺2块6孔板。
2) 感染慢病毒：
12~20h后感染Oct-4干扰慢病毒及对照慢病毒：
a) 根据公式计算病毒用量： （细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μl）。
b) 本实验中MOI取50，吸去与加入病毒体积相同培养基。
c) 每孔加2.5μl的polybrene (1mg/ml)，使polybrene终浓度达到5μg/ml。
d) 24h后换，弃去培养基后每孔加入1.5ml新鲜的培养基。
e) 48h后收集细胞，一块6孔板抽提RNA，备用。
f) 72h后另一块6孔板制备蛋白样品，备用。 
2. Real-time PCR：
1) 总RNA抽提：
说明：根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行，均为RNase-free操作。
a) 离心去细胞上清，每孔加入1000µl Trizol，吹打，室温静置5min，后转移至另一新的1.5 ml 离心管中。
b) 每管加入200 µl氯仿，用力震荡15s，室温静置15min。  
c) 4℃，12000 rpm，离心15min。  
d) 从每管中吸取上清至另一新的1.5 ml 离心管。加入等体积异丙醇，混匀后4℃沉淀 10 min。  
e) 4℃，12000 rpm离心10 min后，去上清。
f) 加入至少1 ml 4℃预冷的75%乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。
g) 4℃，10000 rpm离心5 min，弃上清。
h) 4℃，10000 rpm再次离心5 min，吸去残液，室温干燥（不需完全干燥）。
i) 加入20 µl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
2) RNA逆转录获cDNA：
M-MLV逆转录酶和dNTP购自PROMEGA公司。Oligo dT购自上海生工。RNase -free的物品都购自Axygen。
说明：根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行， 均为RNase－free操作。
a) 将1 µl Oligo dT(0.5µg/µl) 和2.0µg Total RNA加入到PCR小管中，补充DEPC-H2O至9μl。混匀后离心，70℃温浴10min。 之后立即插入到0℃冰水浴中，使Oligo dT和模板退火。
b) 按下表的比例，根据反应管数算出所需的试剂量。将M-MLV酶等在冰上混匀，得到RT反应液。
c) 在每个反应管中加入的11μl的RT反应液，混匀后离心。

d) RT反应在42℃进行1h后完成，之后用70℃处理10min使RT酶失活。
e) 得到的RT反应产物-cDNA可立即用于PCR，也可保存在-80℃以后使用。

3) Real-time PCR检测：
按下列比例配置反应体系 ：
                                 
a) 设定程序为两步法Real-Time定量。预变性95℃，15s，之后每一步变性95℃，5s，退火延伸60℃，30s，共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。

Cycle 1: (1X)
Step 1:   95.0 ℃   for 00:15.
Cycle 2: (45X)
Step 1:   95.0 ℃   for 00:05.
Step 2:   60.0 ℃   for 00:30.
Data collection and real-time analysis enabled.

b) 制作熔解曲线。PCR结束后， 在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA 双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同时读取吸光值。

Cycle 3: (1X)
Step 1:   95.0 ℃   for 01:00.
Cycle 4: (1X)
Step 1:   55.0 ℃   for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1:   55.0 ℃-95.0 ℃  for 00:04.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃

3. Western Blot：
1) 总蛋白抽提：
a) 从培养箱中取出细胞，弃去细胞培养液，PBS洗涤2次。
b) 弃去PBS，加入适量预冷的2×Lysis Buffer，配方：1M Tris-HCl（pH6.8）100mM，巯基乙醇 2%，甘油 20%，SDS 4%。
c) 细胞刮刮下细胞，将样品转移入离心管中，冰上裂解细胞10~15 min。
d) 超声破碎仪破碎细胞（200 W共4次，每次5s，间隔2s）。
e) 混匀后，沸水浴煮5-10 min，4℃存放备用。
2)  SDS-PAGE：
a) 制胶：根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶，具体体系如下：
                            

b) 上样：等胶凝固好后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样。
c) 电泳：30mA 2h。
3) 免疫印迹（湿转）：
电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，400 mA恒流条件下电转120min，将蛋白转移到PVDF膜上。
4) 免疫显色：
a)  封闭：用封闭液（含5%脱脂牛奶的TBST溶液）室温封闭PVDF膜1h。
b)  一抗孵育：封闭液稀释抗体，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育4℃过夜。
c)  洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
d)  二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜2h。
e)  洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
f)  采用Amersham公司ECL+prime Western blotting system试剂盒进行显色。
g)  X光显影：在暗房中进行获得显示条带的胶片加ECL、曝光、显影、定影的。
具体步骤如下：
i. 将PVDF膜置于平铺好的保鲜膜上，以1：1的比例混合A液和B液，将混合液均匀滴加在PVDF膜上，避光反应3-5min。
ii. 将膜取出，稍微沥干多余的ECL底物反应液，放入暗盒，铺上保鲜膜（避免产生气泡），放上X光片（避免X光片的移动），关  
上暗盒，曝光1-2min。
iii. 取出X光片，放入显影液中，约1min后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中至少2min。
iv. 取出X光片，晾干，分析。

四、 实验结果
表1.定量数值及分析(2-ΔΔCt分析法)
           

                                                             图1. qPCR定量数值及统计分析结果
                                                                            ***表示p<0.001

                                                                 图2. Western blot

 从以上数据可以看到，在PANC-1细胞中，四个干扰慢病毒对Oct-4基因均有一定程度的干扰作用，其中PY1002慢病毒的干扰效率在mRNA和蛋白水平分别达到90%和80%以上。

五、 参考文献
1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社