转录组测序及分析

转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。转录组测序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量测序技术进行 cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。相对于传统芯片而言，RNA-Seq无需预先设计探针，即可对任意物种的任意细胞类型的转录组进行检测，能够提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。

一、技术路线

Illumina Hiseq高通量测序平台可对转录组进行测序，Illumina Hiseq测序技术的优点是单次测序获得的数据量大，能够得到更高的覆盖率，检测到更多低丰度的转录本，在已知基因组序列物种的转录组分析中更具优势。

二、数据分析

1．无参考基因组序列的转录组（De novoTranscriptome Analysis）

标准信息分析

1)    对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理；

2)    数据产出统计及测序数据的成分和质量评估；

3)    组装结果分析；

4)    Unigene功能注释；

5)    Unigene的GO分类；

6)    Unigene的COG 分类；

7)    Unigene代谢通路分析；

8)    预测编码蛋白框（CDS）；

9)    Unigene表达差异分析；

10)   Unigene在样品间的差异GO分类和Pathway富集性分析。

定制化信息分析

可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容；

2．有参考基因组序列的转录组（Transcriptome analysis with reference genome）

标准信息分析

1)   对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理；

2)   测序评估；

3)   基因表达注释；

4)   基因差异表达分析；

5)   对基因结构进行优化（仅针对真核生物）；

6)   鉴定基因的可变剪接（仅针对真核生物）；

7)   预测新转录本；

8)   SNP 分析。

定制化信息分析

可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容。

3．链特异性转录组（需提供参考基因序列、参考基因组序列）

链特异性技术，也称 strand-specific RNA sequencing method，是一种能够区分正义链或反义链信息的方法，其对于转录组的功能分析具有十分重要的意义。

标准信息分析

1）  正负链信息；

2）  反义链表达；

3）  其他（分析内容同常规转录组）。

定制化信息分析

可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容。

4．均一化文库

分析内容同常规转录组。

5．非编码RNA测序分析（需提供参考基因序列、参考基因组序列及基因注释结果）

定制化信息分析

可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容。

三、常见问题解答

1. 进行转录组测序对于样品有什么要求？

答：1）请提供总量大于2g的新鲜样品；植物材料应尽量选取幼嫩部位，避免过老的组织。

2）采样后将样品立即用液氮速冻，保存于-80℃（保存期不超过一个月），送样时使用干冰运输（不超过72h）。

3）送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封.

4）样品保存期间切忌反复冻融。

5）样品质量合格与否的判断标准：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA芯片RIN值8.0以上 。

6）请填写完整的送样订单，并提供尽量详细的物种基因组背景资料信息，如基因组大小，基因平均长度，预计表达的数量等。

2．转录组测序时，无参考基因组序列的情况下，有哪些信息分析能进行？

答：1）数据产出统计及测序数据的成分和质量评估

2）组装结果分析（Contig长度分布、Scaffold长度分布、Unigene长度分布）

3）Unigene功能注释

4）Unigene的GO分类

5）Unigene代谢通路分析

6） 预测编码蛋白框（CDS）

7） Unigene表达差异分析（两个或两个以上样品超过十次比对按个性化信息分析收费）

8） Unigene在样品间的差异GO分类（两个或两个以上样品） 和Pathway富集性分析
 

3．转录组测序时，有参考基因组序列的情况下，有哪些信息分析能进行？

答：1）测序评估（比对统计、测序随机性评估、Reads在基因组上的分布）

2）基因表达注释（基因覆盖度、覆盖深度分布等）

3）基因差异表达分析（两个或两个以上样品，超过十次比对按个性化信息分析收费）

4）对基因结构进行优化（仅针对真核生物）

5）鉴定基因的可变剪接（仅针对真核生物）

6）预测新转录本

7）SNP分析

四、相关案例

1. 吸烟与肺癌对呼吸道RNA-Seq影响

图A 为NuGEN (NG)技术与Illumina (IL)技术比较

图B为NuGEN (NG)的reads数与Illumina (IL)的reads相关性

图C在A中发现的呼吸道转录组基因分布

2. 以转录组分析为基础的对宿主感染霍乱弧菌的机制的研究

图A和图B描述了被感染霍乱弧菌的细胞的基因表达(A, rabbit [Illumina]; B, mouse [Helicos])左边为染色体I，右边为染色体II

上图为霍乱弧菌在细胞中和感染期间不同基因表达

五、相关文献

1. Defining the maize transcriptome  de novo using deep RNA–Seq Jeffrey Martin, Stephen Gross, Cindy Choi, Tao Zhang, Erika Lindquist, Chia- Lin Wei, ZhongWang

2. RNA-Seq-Based Monitoring of Infection-Linked Changes in Vibrio cholerae Gene Expression

Anjali Mandlik, Jonathan Livny, William P. Robins, Jennifer M. Ritchie, John J. Mekalanos, and Matthew K. Waldor

3. Characterizing the Impact of Smoking and Lung Cancer on the Airway Transcriptome Using RNA-Seq Jennifer Beane, Jessica Vick, Frank Schembri, et al. 2011;4:803-817. Published online June 1, 2011. Cancer Prev Res