动植物基因组重测序

    基因组重测序是对已知基因组序列物种的个体进行基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行比较基因组学分析。通过全基因组重测序可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNPs）、拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）、插入缺失（InDel）、结构变异（Structure Variation，SV）等变异信息，广泛应用于群体遗传学、临床医药、动植物分子育种等众多领域。

一、             技术路线

推荐平台： Illumina HiSeq 2000、Illumina MiSeq

 二、 生物信息分析

1.    原始数据整理、过滤及质量评估

2.    基因组重测序分析

l  与参考基因组比对

l  SNPs和InDel检测及在基因组的分布

l  CNV和SV检测及在基因组的分布

l  包含变异基因的KOG和GO富集分析

l  包含变异基因的代谢途径分析（KEGG pathway）

3.    根据客户需求进行个性化分析

三、样品要求

1.         DNA样品：浓度≥100 ng/μl，总量≥50 μg，OD260/280值应在1.8-2.0之间，电泳检测无明显RNA条带，基因组条带清晰、完整，主带应在100 kb以上。若样品中有多糖、糖蛋白的残留，对打断DNA样品带来非常大的困难，且很难去除，因此特别要求所提供的样品一定要将多糖或糖蛋白去除干净。

2.         动物样品：对于一般物种应挑选肝脏、肾脏、血液等组织取样，对于珍贵物种请提供耳样、毛发（带毛根）等脂肪含量较少的组织进行取样。为了减少个体差异对后续拼接产生的影响，尽量从同一个个体中取样。若物种体积较小，从一个个体中提取的DNA量不能满足测序实验所需，在保证量的前提下，应尽量减少采样个体的数量。

3.         植物样品：需为黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组织样品。

四、经典案例

案例1：拟南芥的重测序

背景：拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种十字花科植物，在分子遗传学、植物学以及农业科学的研究中发挥了重要的作用，是重要的模式生物，种群间有不同的遗传差异。

目的：利用Roche 454和ABI SOLiD两种高通量平台对拟南芥野生品种Ws-2及其突变株ebi-1进行全基因组重测序，寻找突变相关基因及SNPs。  

结果：ebi-1和Ws-2分别获得了8 Gb和8.5 Gb的测序数据；通过与拟南芥Col-0基因组序列比对，共发现了144,787个共有SNPs，109个ebi-1特有的突变和6个Ws-2特有突变。同时还找到了生物钟相关基因AtNFXL-2，并在此基因上发现了一个SNP，正是这个突变引起了ebi-1的表型变化。

[ Ashelford K, Eriksson ME, Allen CM, et al. Full genome re-sequencing reveals a novel circadian clock mutation in Arabidopsis. Genome Biology, 2011, 12(3): 1186-1198 ]

背景：鸡是第一个完成基因组序列测定的农业动物（2004年），是研究脊椎动物遗传、进化和发育重要的模式生物。

目的：利用高通量测序技术对家鸡及其野生祖先红原鸡进行全基因组重测序，研究鸡在几千年驯化过程中的遗传变异。

结果：研究发现了超过7,000,000个SNPs、1,300个缺失（deletions）和若干选择性清除（selective sweeps）。家鸡中促甲状腺激素受体（TSHR）基因存在显著变异，这也许与被驯化动物的一个典型特征相关。另外，家鸡它没有野生种群中所见的季节性生殖的严格调控。同时，研究发现在肉鸡群体中检测到的几个选择性清除片段，与生长、食欲和代谢调控相关的基因重叠在一起。

[ Rubin CJ, Zody MC, Eriksson J, et al. Whole-genome resequencing reveals loci under selection during chicken domestication. Nature, 2010, 464: 587-593 ]

五、常见问题.

1.              Q： 为什么要进行动植物全基因组重测序？

A：利用二代测序进行动植物全基因组重测序，不仅可以获得大量的单核苷酸多态性（SNPs）信息、序列的插入缺失位点信息，还可以检测到多种结构变异（SV）和拷贝数变化（CNV）。通过对获得的海量信息进行分析比对，能够获得个体或群体间基因组水平的差异，发现或检测与疾病发生相关序列位点信息，开发高密度SNP分子标记，实现遗传进化分析及重要性状候选基因预测。

2.  Q：动植物全基因组重测序需要多少覆盖深度？

  A：重测序的覆盖深度是由所测物种的类型及项目的具体需求决定的。例如，采用Illumina进行人类基因组重测序，如要获得绝大多数的变异信息，一般建议覆盖深度需达30×以上。

案例2：鸡基因组重测序