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Oct-4 过表达2型重组腺相关病毒包装纯化实验

摘要：本实验使用 AAV-2无辅助病毒系统，获得高滴度的过表达human Oct-4基因的重组腺相关病毒颗粒，并使用qPCR方法测定病毒滴度。该病毒系统中外源基因的表达框为pAAV-CMV-Oct-4-IRES-ZsGreen-EGFP：CMV启动子驱动Oct-4基因的表达， 同时由IRES原件驱动ZsGreen基因的表达，可以用于观察重组腺相关病毒的工作状况。
关键词：AAV无辅助病毒系统，Oct-4，高滴度重组腺相关病毒包装，qPCR

一、 实验原理
腺相关病毒属微小病毒( parvovirus)家族的成员，为无包膜的单链线状DNA病毒。AAV的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。重组腺相关病毒具有安全性高、免疫原性低、能介导基因在动物体内长期稳定表达，因而被认为是最有潜力成为基因治疗工具的载体而在国内外研究中广泛应用。
包装重组腺相关病毒时有9中不同的AAV血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，见下表。 重组腺相关病毒可用于基因的过表达 （3kb以下）、shRNA（单条或者多条串联）、miRNA（pre-miRNA或者pri-miRNA）以及可诱导表达。

                                                                                              9种不同血清型对各组织器官细胞的亲和性

重组腺相关病毒包装技术服务包含内容：
1. 重组腺相关病毒载体的构建：将目的基因克隆构建到腺相关病毒载体，根据不同的研究需求，有用于基因过表达的重组腺相关病毒载体、     
用于RNAi的重组腺相关病毒载体等。
2. 重组腺相关病毒病毒包装：重组腺相关病毒载体与辅助载体（客户选定的不同血清型）一起转染AAV-293细胞进行包装，将包装好的病毒纯化和浓缩。
3. 重组腺相关病毒鉴定与质量控制：载体测序鉴定、QPCR测定滴度、感染活性测定。
最常用的重组腺相关病毒载体：

                          重组腺相关病毒基因过表达载体

                             重组腺相关病毒基因干扰载体

二、 实验目的
使用AAV-2无辅助病毒包装系统获得高滴度的过表达human Oct-4基因的AAV-2病毒颗粒，用于研究Oct-4基因功能学研究。

三、 实验步骤
1. AAV血清型以及载体的选择及构建：
本实验选择AAV-2， 并采用pAAV-CMV-Oct-4-IRES-ZsGreen过表达载体，将human Oct-4基因构建到CMV启动子下游， 位于β-globlin 内含子与IRES元件之间。
                            

2. 病毒包装：
1) 复苏AAV-293细胞到15cm 培养皿中。24-72h后，当细胞达到70%汇合度的时候，1:3分盘。48h后，1:10分盘。48h后可以进行质粒转染。
2) 使用obio病毒包装转染试剂，按照使用说明，三种质粒（pHelper：pAAV-RC2：pAAV-CMV-Oct-4-IRES-ZsGreen=1：1：1）共转染AAV-293细胞。
3) 转染60h后，使用细胞刮将细胞刮下，并收集到离心管。
4) 1500g 4℃离心5min。将细胞沉淀重悬在7ml 的 10mM Tris-HCl 缓冲液中。
5) 细胞可-80℃保存直到进行纯化。

3. 病毒纯化：
1) 取细胞裂解液在干冰/乙醇浴-37℃水浴中反复冻融8次。
2) 使用10mM Tris-HCl¬将裂解液定容到21ml。
3) 使用Misonic Sonicator超声仪超声7min（输出2）。
4) 加入2ml DNase I（3mg/ml）37℃孵育30min。
5) 再次超声7min。
6) 加入2.5ml 10% 脱氧胆酸钠，2.1ml 0.25%胰酶-EDTA，混合均匀后37℃孵育30min，冰上放置20min。
7) 加入16.9g CsCl。混合均匀后，37℃孵育20min。中间摇动，直到CsCl完全溶解。
8) 4℃3000g离心30min，小心地将细胞裂解液转移到超速离心管（约5ml/tube）。
9) 4℃53,000rpm (266,400g)离心30h。
10) 使用自制的针头收集病毒层。
11) 4℃透析，12-16h换透析液，每次使用4L缓冲液。

4. 滴度检测：
1) 取2μl 纯化后的病毒液加入50μl PCR 碱性裂解液中，100℃，加热10min。放置冰上10min，加入50μl中和缓冲液。（同时准备质粒对照模板：106-1011拷贝/μl）。
2) 按照以下体系准备qPCR样品（20μl体系）：10μl SYBR green master mix， 0.3μl 正向引物，0.3μl 反向引物，1μl模板，8.4μl 水（RSV promoter：正向: GGTTGTACGCGGTTAGGAGT；反向：GGCATGTTGCTAACTCATCG）。
3) 分析滴度。

5. 病毒表达检测：
1) HEK-293细胞按照2×105/ml重悬后铺盘到12孔板中。
2) 24h后，选取两个孔进行细胞计算。
3) 按照5,000 GC/cell准备AAV病毒（对照病毒以及Oct-4-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒）：细胞数目×5,000 GC/100μl培养基。
4) 吸取12孔板中上清，加入100μl培养基。放入培养箱中培养90min，中途轻微晃动。90min后每孔加入900μl培养基，继续培养48h。
5) 显微镜下观察，拍照。

四、 实验结果
                                                           计算显示Oct-4-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒的滴度为6.1 X 1010 GC/ml (genome copies/ml).

                                                                                  
                                                      图1. 对照病毒（左）以及Oct-4-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒（右） 感染HEK-293细胞（5,000 GC/cell）
qPCR结果显示，Oct-4-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒的滴度达到6.1 X 1010 GC/ml (genome copies/ml) 。
在未添加腺病毒或其它促进表达的药物的情况下，5000GC/ml的Oct-4-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒感染HEK-293细胞48h，感染效率可以达到80%以上。
 
五、 参考文献
1. Senapathy P, Carter BJ. Molecular cloning of adeno-associated virus variant genomes and generation of infectious virus by recombination in mammalian cells.J Biol Chem. 1984;7: 4661-4666.
2. Wang L, Blouin V, Brument N, Bello-Roufai M,et al.Production and purification of recombinant adeno-associated vectors.Methods Mol Biol. 2011;807:361-404