大鼠心脏组织明胶酶谱MMP活性检测实验

实验仪器  泳电源Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；电泳仪及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)

实验标本  大鼠心脏组织20个

实验试剂

1、凝胶试剂：30%丙烯酰胺溶液；Tris-Base（SIGMA）；10%SDS（SIGMA）；10%过硫酸铵；TEMED（sigma）
2、常用溶液及缓冲液：制备含MMP底物蛋白SDS-PAGE凝胶：采用8%分离胶。将20Xsubstrater融化，并90℃加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中加入20Xsubstrate并使之稀释20倍，混匀，然后再加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。
A．5%积层胶所用溶液
按总体积2.5ml：
ddH2O：                               1.575ml
30%丙烯酰胺溶液：                      0.42ml
1.0mol/L Tris (PH=6.8)：              0.315ml
10%SDS：                              25ul
20Xsubstrate：                        125ul
10%过硫酸铵：                          25ul
TEMED：                               3ul
B．8%分离胶溶液
按总体积10ml：
ddH2O：                               4.1ml
30%丙烯酰胺溶液：                      2.7ml
1.0mol/L Tris (PH=8.8)：              2.5ml
10%SDS：                              100ul
20Xsubstrate：                        500ul
10%过硫酸铵：                          100ul
TEMED：                                6ul
C．电泳缓冲液，1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。

检测步骤

A、 阳性对照及待检测样品的前处理及上样 阳性对照：取5ul positive mixture与2XSDS-PAGE non-reducing buffer 等体积混合。待测样品5ul则1：1稀释于2XSDS-PAGE non-reducing buffer，混合后直接上样。不加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。每孔点样10ul。
B、电泳 30mA恒流电泳45min，溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
C、洗涤凝胶 驱除凝胶，去除压缩胶。放入容器中，先用适量蒸馏水冲洗凝胶。然后加入10ml 1Xbuffer A，室温漂洗凝胶2X15分钟。中间换液2次。
D、孵育 倒掉Buffer A。加入10ml 1Xbuffer B，室温孵育4小时。
E、显色 倒掉Buffer。加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液水平摇床上染色120min后，再采用脱色液（甲醇浓度为25% ,乙酸浓度为10 %）进行脱色60min。
F、条带扫描 将凝胶放在扫描仪上扫描。用非透射光扫描，显示调整为灰度。并分析IOD值。72 kDa为MMP-2，92 kDa为MMP-9。
试剂盒组成与储存

1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, −20 ℃
2. MMP-2 and MMP-9 positive mixture 500 µl, −20℃
3. 10 × Substrate G, 50 ml, −20℃ 
4. 10 × Buffer A, 50 ml, 4℃
5. 10 × Buffer B, 50 ml, 4℃
6. 10 × Mem-Gel Stain, 50 ml, 4℃

实验结果

注：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。(例如：1.33E+05=1.33×105)。   P: positive mixture   每孔点样蛋白约10ug