长链非编码RNA测序

长链非编码RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度大于200 nt且不编码蛋白质的RNAs（不含rRNA），广泛存在于各种生物体内。lncRNAs参与表观遗传、转录以及转录后等多水平的调控过程，在生命活动中具有重要作用。本公司lncRNA测序服务使用高通量测序技术结合先进的生物信息学分析，一次性获得样本中几乎全部的lncRNAs信息，为您全面、深入地研究lncRNAs的功能提供了全新的工具。

一、实验流程

1. 样品提取总RNA后，去除rRNA。

2. RNA片断化。

3. 以短片段为模板，用六碱基随机引物反转录合成双链cDNA。

4. 经纯化、末端修复、加碱基A、加测序接头的步骤，根据测序长度和是否做对读测序，确定琼脂糖凝胶电泳回收片段的大小，并进行PCR扩增，完成测序文库的制备。

5. 构建好的文库经cBot扩增，用Illumina Hiseq2500进行对读测序。 

二、数据分析

1.      数据产出统计及质量评估

2.      Reads与参考基因组序列或转录组序列比对

3.      Reads在基因组上的分布统计

4.      转录组表达量的计算

5.      基因差异表达分析

6.      差异基因生物学通路分析

7.      差异基因的GO分析

8.      非编码RNA（lncRNA）鉴定(转录本组装、鉴定已知转录本及预测新转录本)

9.      非编码RNA（lncRNA）定量及差异表达分析

10.   非编码RNA（lncRNA）功能预测

 案例：通过RNA测序分析帕金森病中白血球的长链非编码RNA及选择性剪接的调控

背景：人类寿命的延长伴随着神经退行性疾病的发病几率的增加，因而价格不贵的血液诊断的发展迫在眉睫。通过RNA-seq分析血液细胞的转录本是发现新的生物标志物的非常高效的途径。

目的：利用Illumina测序平台对帕金森病人白血球中lncRNAs进行分析，探讨其对mRNA选择性剪接的调控机制。

结果：通过对帕金森病人的RNA-seq结果分析发现，在白血球中有6000个以上lncRNAs，其中13个lncRNAs较对照组表达变化显著，例如U1剪接体lncRNA，RP11-462G22.1等。同时，在帕金森病人的大脑中表达7000多种lncRNAs，其中有3495种与白血球是共表达的。该研究为帕金森及其他神经退行性疾病的转录调控的研究提供了新的思路。

原文索引：

Pauline A. van Schouwenburg,  Emma E. Davenport (2015) Application of whole genome and RNA sequencing to investigate the genomic landscape of common variable immunodeficiency disorders Clinical Immunology, 160 (2), 301–314

图1：不同样品间的差异表达lncRNAs

图2：不同样品间差异表达可变剪接子

图三：差异可变剪接子的相关信号通路网