X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸环己胺盐（X-beta-D- glucuronide CHA salt）

——转基因植物最常用报告基因GUS显色底物，GUS染色定性研究

作用机制：

X-Gluc，也称为5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸），是β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）的显色底物，由一种广泛使用的报告基因gusA（uidA）所编码。GUS水解X-Gluc，生成一种无色的葡萄糖醛酸和一种肉眼可见的氯-溴靛蓝（chloro-bromoindigo）深蓝色沉淀。利用这一特性，X-Gluc常用来检测植物细胞和组织中的GUS表达；另外，X-Gluc还能用来检测大肠杆菌引起的感染状况；或检测食物或水源是否受细菌污染。

主要应用：转基因植物报告基因GUS活性检测，X-gluc用作显色底物。

普遍应用优势在于：绝大多数植物细胞内不存在内源性的GUS活性，而且GUS基因表达产物具有检测方法简单、灵敏度高，易于定量及定性分析，能够与其他蛋白质基因融合等优势，因此，GUS基因为植物工程研究中应用最广泛的报告基因（报道基因）之一。

1. GUS活性检测（组织化学定位法，定性研究）

GUS催化底物X-gluc在酶活性位点生成深蓝色沉淀，为研究外源基因在植物中表达具体部位研究提供很好的研究手段。且GUS酶和显色产物非常稳定，植物中可以积累。

1.1 GUS染色液制备【作为参考，可按照具体实验条件来调整】

1.2 GUS定性染色步骤

a）于预冷固定液（4%多聚甲醛溶液，新鲜制备）固定样本30min，偶尔摇晃或置于低速摇床上固定；

b）使用预冷的1×磷酸盐或柠檬酸盐酸溶液清洗固定样本30-60min，中间更换几次清洗液；

c） 真空渗透法将X-Gluc染色液加入待染色样本【对于组织培养的拟南芥不需用真空渗透；】黑暗条件室温或者37°C孵育几小时或过夜，或者明显的蓝色沉淀出现（不超过24h）；

d）去离子清洗染色样本；

e） 对于绿色样本，使用70%乙醇脱色直到叶绿体完全去除，然后转移到去离子水内清洗；对于种子或其他样本，参考文献An Improved Clearing Method for GUS Assay inArabidopsis Endosperm and Seeds的替代方法；

f） 肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。

2. GUS活性检测（荧光分析法，定量研究）

GUS催化荧光底物MUG 4-甲基伞型酮-beta-D-葡糖苷酸，将其水解为4-MU（4-甲基伞型酮）和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羟基解离后在365nm的光激发下产生455nm的荧光。此时用荧光分光光度计测定得到的是相对值，因此同时需要用标准物4-MU进行校准。

荧光定量分析GUS活性有两种基本方法：

1）在一个时间点测定GUS酶作用产物的总荧光量，需要设定空白对照，以消除内源荧光强度；

2）测定一段时间内GUS的动力学过程。在酶反应初始阶段，酶作用产物与时间呈线性关系，而内源性荧光物质的荧光量与时间无线性关系。由此可计算GUS酶活力。GUS酶活性通常以μg MU/min/mg蛋白质。有时也可以用样本的鲜重来表示。

2.1 检测步骤【仅作参考，根据具体实验条件做适当调整】

a）取约100mg愈伤组织或一片新鲜叶盘于1.5ml离心管内，加入100μl萃取缓冲液（extraction buffer）内匀浆。可加入少量沙子或玻璃珠提高研磨效率。

萃取缓冲液（extraction buffer）配方：50mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0），10mM DTT，1mM Na2EDTA，0.1%十二烷基肌氨酸，0.1% Triton X-100

b）4°C，15,000rpm离心5min。收集上清转移到另一干净的1.5ml离心管，冰上放置待用。

c） 取50μl上述萃取上清到0.5ml 37°C预热的反应缓冲液（Assay buffer）；用移液枪吹匀或漩涡混匀。

反应缓冲液（Assay Buffer）：称取17.6mg MUG溶于50ml萃取缓冲液，此时即为1mM MUG反应液。4°C保存，2周稳定。

d）在某一时间段内（高GUS活性样本30min；或低GUS活性1h-过夜；）吸取100μl溶液到含900μl终止液（Stop Buffer）的1.5ml离心管内，做好标记。有可能采集3-4个时间点和过夜孵育的时间点荧光量。【用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm时测定不同时间点的荧光强度值。】

e）以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，求出单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。

基本特性：

1）CAS NO：114162-64-0

2）英文同义名：5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid, cyclohexylammonium salt;X-beta-D- glucuronide CHA salt;X-Gluc CHA Salt; X-glu CHA Salt; X-glcA CHA Salt; BCIG CHA Salt;

3）分子式：C14H13BrClNO7 • C6H13N

4）分子量：521.79g/mol

5）纯度：＞99%（HPLC）

6）外观：白色至类白色结晶性粉末

7）溶解性：DMF、甲醇