基因敲入

简介

      CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ Cas）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统，此系统是由II类CRISPR/Cas系统改造而来，能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中，进行有效的靶向编辑，具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。

CRISPR/Cas9系统中sgRNA（short guide RNA）识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂，通过细胞内的同源重组修复方式，将外源供体DNA定点导入至基因组的靶位点中，从而实现基因敲入。

CRISPR/Cas9基因敲入示意图（Eric Murillo-Rodríguez et al., Sleep and Vigilance, 2018）

应用

      1.CRISPR/Cas9基因片段敲入细胞系建立

      2.CRISPR/Cas9基因单碱基突变细胞系建立

      3.CRISPR/Cas9基因敲入建立动物疾病模型

技术优势

      1.操作简易:仅需Cas9核酸酶、sgRNA和供体DNA片段(donor)，即可定点敲入外源基因片段;

      2.效率高:在基因组水平上编辑目标基因，高度模拟目标模型，可精确编辑基因组;

      3.广谱性:无物种限制、无细胞种类限制;

      4.提供多种基因编辑病毒工具:AAV、LV;

      5.提供BSL-1和BSL-2病毒注射及实验操作平台;

      6.全面的实验技术支持。

服务内容

      1.sgRNA的设计;

      2.细胞内sgRNA剪切活性筛选;

      3.敲入载体的构建:Cas9-sgRNA表达质粒、donor质粒;

      4.依据所要编辑的细胞选择Cas9、sgRNA和donor不同导入方式:

            a、脂质体易转染细胞:使用质粒系统( Cas9、sgRNA和donor ) ;

            b、脂质体难转染细胞:使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染( Cas9、sgRNA和donor ) ;

      5.筛选基因敲入单克隆细胞系。

服务流程

客户提供

      1. 目的基因序列（序列/ID）以及物种来源；

      2. 靶细胞系及细胞培养条件（可选）；

      3. 病毒类型选择以及要求；

      4. 血清型选择。

服务信息及最终交付内容、产品

      声明：枢密科技提供的所有基因编辑服务及该服务的后续研究，仅适用在国家法律和伦理规范的范围内实施。禁止用于任何人体或临床实验的研究；禁止用于对人类生殖体系进行基因修饰的研究；禁止将基因修饰的其他动物胚胎及生殖细胞植入人体。客户如违反相关法律规定，本公司不承担任何法律责任。

案例展示

      Yang H等人研究发现，通过同源重组在Nanog基因第4个外显子末端插入报告基因荧光蛋白cherry（A）。Southern显示重组成功（B）。Nanog基因只在胚胎干细胞表达，干细胞分化后Nanog基因不再表达，表现为干细胞表达荧光蛋白cherry，分化后的细胞无荧光（C）。

（Yang H et al. Cell, 2013）

参考文献

      [1] Eric Murillo-Rodríguez, Rocha N B , André Barciela Veras, et al. The End of Snoring? Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing for Sleep Disorders[J]. Sleep and Vigilance, 2018, 2(1):1 3-21.

      [2] Yang H, Wang H, Shivalila CS, et al. One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 2013;154(6):1370-9.