反应条件及使用建议

l          反应混合体系配制建议：

-        一般建议至少配制比样本多一个反应体系的混合体系(例如：如需要8个样本，配制9个混合体系)。

-        建议添加无模板对照(Non-Template control，NTC) ，即添加DEPC-H₂O 取代模板。

l          反转录

cDNA合成所需温度，可以在37℃～45℃进行设置，根据模板和反转录引物，选择特异性好，效率高的温度。

l          热启动DNA聚合酶

EzOmics^TM 一步法qPCR检测试剂盒中使用的是热启动Taq DNA聚合酶，在常温条件下，酶的活性受到抑制。只有通过95°C反应10 min，激活热启动酶的活性，参与下一步qPCR反应。

l          MgCl₂ 浓度优化

MgCl₂ 是DNA聚合酶的一个复合因素。终浓度为3mM的MgCl₂ 浓度适用于大部分反应。然而，MgCl₂的需求往往不尽相同，这取决于特殊的模板和引物。尤其是使用SYBR Green I荧光探针时，往往需要更高浓度的MgCl₂。

建议针对合适的模板，设计3个重复反应，按下表格给的MgCl2浓度梯度。下表为50μl体系中MgCl₂达到各终浓度时的需要加入的量。

根据实验结果，分析扩增效率、熔解曲线等，选择最佳的MgCl₂ 浓度用于之后的相关qPCR的实验。

l          引物设计和浓度

大多数情况下，引物终浓度为200nM是能够满足PCR反应。不过，根据特殊的模板和引物，引物终浓度可以在25 ~ 900 nM范围内进行优化。引物设计可借助于实时荧光定量PCR引物（探针）设计软件（如：Beacon Designer）。为获得最佳定量结果，产物大小最好控制在80 ~ 200bp的范围内。

l          模板浓度

过量的模板会抑制反应的进行。通常情况下，每50μl反应体系中，总RNA含量在10ng～200ng是足够的。当然特殊的基因会有所不同。

l          探针浓度

多数情况下，引物和探针的摩尔比控制在3:1比较合适。根据实际情况，探针的浓度可在10 ~ 250 nM范围内进行优化。

l          熔解曲线分析

如果使用SYBR Green I染料法，建议在qPCR反应结束后进行熔解曲线分析，若仪器含有此功能。请参照仪器制造商推荐的使用方法说明。不含模板的阴性对照（NTC）用来确定反应过程中是否存在引物二聚体，含有模板的反应体系确定产物是否单一。

注：可以跑琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的特异性。

实验方法

l          SYBR Green I 染料法