人Oct-4启动子报告基因载体构建

摘要： 以人基因组为模板扩增Oct-4¬¬启动子序列并构建入pGL3-basic载体萤光素酶报告基因上游。根据萤光素酶的表达水平检测Oct-4启动
子转录活性。
关键词：Oct-4，启动子， 转录活性， luciferase， 报告基因

一、 实验原理
PCR扩增Oct-4启动子序列， 构建于pGL3-basic载体luciferase上游。根据萤光素酶的表达水平检测Oct-4启动子转录活性。
pGL3-basic载体图谱如下：

二、 实验目的
构建用于检测Oct-4启动子活性的质粒载体。

三、 实验方法
以人基因组DNA为模板扩增Oct-4启动子序列，与经Mlu I和Xho I酶切后的pGL3-basic载体片段同源重组后转化E.coli感受态细胞。用菌落PCR鉴定转化子，筛选到的阳性克隆送测序。测序无误的克隆进行质粒抽提。实验步骤如下：

1. 引物设计：
从GenBank中查询目的基因上下游的序列，用Vector NTI软件进行引物设计。
PCR扩增目的片段：
使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的片段，反应体系和条件如下：

2. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果：
目的片段PCR扩增成功后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过和DNA Marker的对比，判断目的片段是否扩增成功。
3. 胶回收目的片段：
把目的片段条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。
4. 线性化表达载体的制备：
用限制性内切酶对含报告基因载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg， 10 x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
5. 目的片段同源重组到线性化报告基因载体载体中：
将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应：

混匀后在42℃孵育30min，然后转移到冰上。放置2-3min后取10μl反应液体转化到感受态细胞中。
6. 感受态细胞的制备和转化：
DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》。
7. 菌落PCR鉴定阳性转化子：
挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

 
8. 阳性克隆送测序：
菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
9. 质粒小提：
经测序验证正确的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 实验结果
1. PCR扩增目的片段：
用正向引物GTTTATCGATACGCGTTTCCCATGTCAAGTAAGGG（引物说明：含同源重组序列、Mlu I酶切位点，并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因），反向引物GAAGCTTGAGCTCGAGGGGAAGGAAGGCGCCC（引物说明：含同源重组序列、Xho I酶切位点下划线标记的， 并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因） 对人基因组DNA进行扩增， 预期PCR产物大小为3948 bp，电泳结果如下：
                                            1     2

                                        
1． PCR产物
2． 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
2. 报告基因载体的线性化：
用Mlu I和Xho I对报告基因载体进行双酶切，胶回收4801bp的载体片段，酶切图谱如下：
                                          1   2   3

                                    
1． 空质粒
2． 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
3． 经Mlu I和Xho I双酶切的pGL3-basic载体
3. 菌落PCR鉴定阳性克隆：
用菌落PCR鉴定转化子，正向引物Oct-4-F：GCCTACCGTGGTATTAGATGTC位于目的基因序列中，反向引物Luc-N-R：  CCTTATGCAGTTGCTCTCC位于萤光素酶基因的N端序列，阳性克隆得到1324bp的片段。电泳结果如下：
                            1     2     3     4     5     6     7     8    9   10   11

1． 阴性对照（ddH2O）
2． 阳性对照（GAPDH）
3． DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8个转化子
接种阳性克隆，保种并分装100μl送测序。测序没有问题的，再接种抽提质粒。

4. 测序结果分析：

                    阳性克隆测序结果表明，和预期序列完全一致。

五、 参考文献
1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社