实时荧光定量PCR技术

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服务概述

实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

我们为客户提供实时荧光定量PCR全套技术服务，客户只需提供研究材料，我们为客户完成RNA抽提，cDNA制备，实时定量PCR，标准曲线制备及数据分析的所有步骤。本公司使用晶芯® RT-Cycler 实时荧光定量PCR仪，独特的离心式热循环设计和光学设计，具有超凡温度均一性，高灵敏度、线性范围宽、特异性好、重复性佳。可以提供的服务包括TaqMan荧光探针法和SYBR Green荧光染料法。

服务内容

定性分析：对待测样品进行某一特定基因的检测。PCR反应结束后的PCR产物无需电泳检测，可以通过Real Time PCR方法，简单快速地对目的基因进行高特异性、高灵敏度的检测，同时闭管操作的实时检测可以有效防止反应产物的污染。本技术可以广泛应用于病毒、病原菌等致病微生物的检测以及各种生物品种的鉴定等。

绝对定量：对待测样品进行某一特定基因的检测并确定样本基因的拷贝数。绝对定量首先必须构建与检测样品目的基因具有相同序列的标准品。使用已知浓度的标准品制作5个点以上的标准曲线后，可以使用标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量（起始拷贝数）分析。

相对定量（mRNA表达量分析）：对待测样品进行某一特定基因的检测并确定待测基因相对于某一特定管家基因的相对表达情况。基因表达的研究一般采用相对定量的方法。相对定量法必须对样品的目的基因和参比基因内标同时分别进行定量，然后求出对于参比基因的目的基因的相对量。通过对样品间的目的基因的相对量进行比较，可以对不同样品间的mRNA进行表达量分析。参比基因通常选用表达量相对恒定的管家基因，如：β-actin、GAPDH等。通过同时对参比基因的实时检测，可以对样品之间由于起始细胞数不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量误差进行校正，达到在严格意义上对样品之间的mRNA表达量进行分析比较的目的。

检测方法：SRBR Green I染料法，TaqMan探针法。

样品要求

1. 请提供足量且新鲜的材料（大于200mg/样品或107细胞以上），或直接提供纯化好的总RNA或DNA（大于5μg/ 样品）。如果提供的材料为细胞或组织，DNA、RNA抽提费用另计；

2. 请通过 E-mail 提供已知的全长基因序列；

3. 请提供尽可能详细的背景资料：DNA/RNA来源、丰度等。 

服务流程 

1. 引物设计与合成：根据客户提供的目的基因及物种信息，设计、合成特异的引物和探针，并根据客户的具体研究情况选择适宜的内参基因；

2. 提取 DNA/ RNA，RNA定量，逆转录成cDNA；

3. 利用合成的引物进行普通PCR预实验，选择只扩增出一条特异条带的引物进行定量PCR，制备绝对定量标准品，建立标准曲线； 

4. 进行Real Time PCR实验，分析实验结果； 

完成时间

根据合同要求时间完成。

最终产品

实验完成后提供完整的实验报告，包括样品质检报告、实验数据分析、实验方法及样品的PCR扩增曲线，溶解曲线和标准曲线。

服务费用

服务过程分为两部分：

第一部分的工作为条件的摸索和方法的建立。主要工作：根据客户提供的资料，进行引物和探针的设计，并先合成引物，由客户提供2-3个有效的样品进行样品的试扩增，并测序验证，在此基础上再进行探针的合成，并用该探针进行实验条件的摸索工作。

第一部分的费用询价。

第二部分的工作为样品的定量工作。该工作是在完成第一部分的工作基础上进行，包括每一个样品的扩增定量及管家基因的扩增。

第二部分的费用按样品数*基因收费，组织和细胞样品费用询价；RNA费用询价；cDNA费用询价。