de novo基因组测序及分析

de novo测序（也叫从头测序），是指不用任何参考序列而对某个物种进行测序，用生物信息学方法进行组装，最终获得该物种的基因组序列图谱。

目前，全基因组测序已逐步成为各个物种基础研究的重要手段之一。通过基于新一代高通量测序技术的全基因组测序，可以预测重要基因和蛋白以了解其功能和可能机制。在研究病原菌的致病性与疾病的预防和治疗方面，可以鉴定致病相关基因、开发和研究疫苗、开发新型抗生素等；在研究细菌进化方面，可以研究种内进化关系；合理利用有益真菌，对控制和预防有害真菌对人类的生产和生活具有重要意义。在大型动植物领域，更是对该物种的进化研究，基因改良育种有重大的作用。

一、技术路线

de novo测序技术路线图

二、技术指标

本指标具体根据所分析的物种可能会有变化，请与当地销售代表联系

三、 生物信息分析

可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析服务内容。

四、 相关案例

图a为装配基因测序深度的分布；图b为装配基因与BAC序列的对比

图a为对齐与不对齐的非重复序列的长度；图b为将人、熊猫和狗的染色体同线的位于同一条染色体上

五、 常见问题

1. 第二代测序技术与传统Sanger测序相比有什么优势？

答：第二代测序技术的测序通量是传统Sanger法的上万倍，并且可以进行长片段双末端测序，将测序数据拼接成较长的Contig和Scaffold。与Scaffold法相比，具有高通量、高灵敏度、高准确性、低成本和耗时短等多个突出优势。如人类基因组测序是六个国家耗资27亿多美元历经10年才完成的，而如今利用第二代测序技术平台，只需几个月就可以完成。

2. 测序的实验周期是多久？

答：根据具体基因组大小和复杂程度来确定完成时间，一般地从获得样品到高通量测序完成，细菌等小基因组需要1-2个月，其他基因组需要2-6个月。

3. DNA样品的送样要求如何？

答：DNA样品总量不小于10µg，浓度≥200ng/µL，OD值在1.8-2.0之间，样品浓度越高越好。请填写完整的送样订单，用自封袋密封后随同样品一起附干冰送样。

4. 是否需要生物学重复？重复几次？

答：是的，至少需要两次生物学重复，3次以上的生物学重复更好。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性，与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复，高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。把这篇文章列在参考文献里吧

5. 如何检测基因组组装的准确性？

答：目前，主要可以通过以下几种方法来检验基因组组装的准确性。（1） 通过构建BAC或Fosmid文库，并进行常规测序，将所得序列与拼接好的Contigs作比对以判断基因组组装的准确率。（2）将已知的基因序列与拼接好的Scaffold作比对，查看两者是否吻合，吻合度越高，表明基因组组装越好。而且已知的基因序列越多，评价结果越可靠。（3）估计组装后基因组的单碱基准确度，利用新一代测序技术，如果95%以上的基因组单碱基覆盖度超过20×，则认为该见机组的单碱基准确度较高。

6.      如何避免基因组中的重复序列造成的组装错误？

答：应用新一代高通量测序技术，构建200bp、500 bp、2 Kb、6 Kb、10 Kb、20 Kb等不同大小的DNA测序文库，进行双末端海量测序，可以避免基因组中的重复序列造成的错拼。当测序数据量达到基因组大小的60倍以上时，即可保证基因组的完整性和序列中单碱基的准确性。

六、 相关文献

1. Li R, Fan W, Tian G, Zhu H, et al The sequence and de novo assembly of the giant panda genome. Nature 2010 Jan 21; 463:311-17. Epub 2009 Dec 13