ECL Western Blotting检测试剂盒
产品名称： ECL Western Blotting检测试剂盒
英文名称： ECL Western Blotting Detection System
产品编号： M20401
产品价格： 0
产品产地： Mbchem
品牌商标： Mbchem
更新时间： null
使用范围： null
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产品说明
ECL
（底物化学发光）Western Blotting Detection System是一种高灵敏度的检测系统，利用新型的化学发光底物（luminol），可检测pg级的抗原。Luminol可与免疫印迹中用到的辣根过氧化物酶结合，产生极强的光信号，持续时间长、稳定性高，检测方便。光信号支持重复曝光，以获得最佳的结果。重要的产品信息
1. 对于每个Western Blot系统来说，选择适当的封闭剂都是至关重要
的。封闭剂与抗体的结合会导致非特异性的信号，并且也影响反应的灵敏度。用卵白素或生物素系统的时，应避免使用牛奶做封闭剂，因为牛奶含有多种内源性生物素，会导致极高的背景信号。
2. 杂交过程中，使用足量的清洗缓冲液、封闭缓冲液、抗体溶液和
底物工作液，避免杂交膜干。使用大量的封闭和清洗缓冲液可将非特异性信号降到最低。
3. 为了得到更好的结果，在孵育过程中可使用摇床
4. 在封闭液和所有稀释过的抗体溶液中加入Tween 20（终浓度
0.05-0.1%）可以将非特异性信号降到最低。使用质量好的Tween 20（如Pierce生产的SURFACT-AMPS－20），以确保其中不含过氧化物和其
他杂质。
5. 不要将叠氮化钠用于缓冲液的保存。因为叠氮化钠是辣根过氧化
物酶（HRP）的抑制剂，会影响整个反应的结果。
6. 不要直接用手接触反应膜，戴手套操作或使用干净的镊子。
7. 所有器具必需干净，没有外源杂质；不要使用生锈的金属器具（如
剪刀），以免产生小斑点和很高的背景。
8. 日光或其他的强光照射会损伤反应底物。用棕色瓶保存底物工作
液
还需准备的试剂
1. 稀释缓冲液：Tris缓冲液（TBS）或磷酸缓冲液（PBS）；
2. 洗涤缓冲液：加入5-10ml 10% Tween至1000ml稀释缓冲液，终浓度
为0.05-0.1%；
3. 封闭剂：加入0.5-1ml 10% Tween至100ml封闭缓冲液（如PBS或TBS封闭缓冲液）中。选择与稀释缓冲液组分一致的封闭缓冲液；
4. 一抗：针对靶蛋白选择一种抗体，并用稀释缓冲液或洗涤缓冲液制备抗体储液。然后将1mg/ml的储液用封闭剂或洗涤缓冲液按照1:100-1:5,000比例稀释成10.0-0.2 μg/ml 工作液。最优稀释比例取决于具体的免疫印迹系统，如靶抗原，具体的一抗和二抗，以及杂交膜的的种类等因素；
5. 辣根氢氧化物酶(HRP)标记的二抗：选择一种能与一抗特异性结合的带辣根氢氧化物酶(HRP)的二抗。抗体用稀释缓冲液或洗涤缓冲液制备成抗体储存液。1mg/ml抗体储存液由封闭剂或洗涤缓冲液稀释成1.0-0.067 μg/ml工作液或按照1:1,000-1:15,000比例稀释，该浓度范围同样适用于HRP修饰的抗生蛋白链霉素。最优稀释比例取决于具体的免疫印迹系统，如靶抗原，具体的一抗和二抗，以及杂交膜的的种类等因素；
6. 准备放射自显影用的胶片暗盒、显影和定影试剂；温育过程中用使用摇床震摇杂交膜
使用方法
1. 使用合适的方法进行Western Blot，直至用PBS/TBS洗涤二抗。
注意：与HRP-二抗交联物反应后，膜片需洗涤彻底；
2. 试剂A和试剂B按1:1混合后，用双蒸水10倍稀释，混合后即为
ECL工作液；
注意：为获得最好的效果，ECL工作液应新鲜配制。该工作液在室温下的稳定时间不超过1hr；
3. 印迹膜蛋白面朝上，用ECL工作液均匀滴加至印迹膜室温孵育1-2
分钟；ECL工作液使用量大约为0.125ml/cm2膜或根据个人实验习
惯使用；
4. 用平头镊夹住印迹膜，垂直置于吸水纸以吸去多余工作液；
5. 快速将印迹膜置于二层保鲜膜之间，尽量赶尽气泡。、；
6. 将印迹膜蛋白面朝上，放于X光胶片暗盒内。在暗室内放入X光
片，曝光，显影。
注意：曝光时保持胶片的干燥。
为取得最佳效果，请遵照以下注意事项：
a.确保杂交膜和塑料保护膜上除净多余的工作液。
b.戴手套操作整张胶片。
c.不要将杂交后的膜片放置在已显影的胶片上，因为胶片上的化学物质会使信号降低。
警示：胶片和杂交膜之间的任何位移都会造成胶片上的噪音。