- 联系人 : 谷小姐
- 地址 : 上海市闵行区浦江镇联航路1239弄8B号3楼
- 邮编 : 201112
- 所在区域 : 上海
- 电话 : 181****9791 点击查看
- 传真 : 点击查看
- 邮箱 : gulingzhi@yingbio.com
具体实验操作步骤
1、脱蜡:
1)二甲苯脱蜡3次,每次5min;
2)100%酒精两次,每次2min;
3)移出酒精,斜置切片,标记末段向下,空气干燥。
2、蛋白酶处理:
1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液,配制方法如下:2×SSC 40ml倒人Facal管,在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内,摇动直到酶溶解。
2) 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3) ×SSC在室温下漂洗切片3次,每次1min。
4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。
3、变性:
1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液;
2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸;
3)78℃孵育8min;
4) 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min,再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内,每缸2min;
5)空气干燥。
4、杂交:
1)准备探针;
2)取一个较大的湿盒,交叉放置切片;
3)滴10μl探针在切片的组织上,加盖玻片;
4)盖上湿盒盖,37℃孵育12h~16h。
杂交后的水洗:
5)镊子小心去除盖玻片;
6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min;
7)2×SSC(37℃)洗两次,每次10min;
8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测,勿使切片干燥。
检测:
9)从1×PBS中取出切片,除去过多的水分,避免标本干燥。把切片放入湿盒内,同时处理4张切片。
10)每张切片使用30μl~60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素,室温下孵育20min;
11)去掉塑料盖膜,把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次,每次2min。
扩增:
12)从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出;
13)每张切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20min;
14)去掉塑料盖膜,把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次,每次2min;
15)从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出;
16)每张切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20min;
17)1×PBS室温下洗3次,每次2min。
5、细胞核染色:
1)张切片加10μl~20μl DAPI,覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5ml;
2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。