概念

细胞凋亡，也称为程序性细胞死亡，是机体为维持内稳态、正常发育，清除冗余，损坏或感染的细胞的一种主动生理过程，也是一种防御机制。

特征

细胞凋亡发生时会有形态和生化改变的显著特征。形态变化主要体现在细胞皱缩，体积变小，细胞质膜起泡，到凋亡晚期时出现凋亡小体。凋亡小体包裹着细胞器和细胞核碎片，它们被巨噬细胞、薄壁细胞所吞噬，被吞噬溶酶体所降解，因而避免炎症反应的发生。生化改变的典型特征是染色体的固缩和DNA片段化。核小体间连接区的双链DNA片段化后其大小均为寡核小体DNA长度(180-200bp)的整倍数，因而在琼脂糖凝胶电脉中呈现规则的“梯子”形(DNA ladder)。“DNA ladder”的出现可作为判别细胞凋亡的特异性指标，但若未检出“DNA ladder”，亦不能排除凋亡的可能。

凋亡途径

细胞凋亡可以在不同的刺激下诱导发生，在哺乳动物中，细胞凋亡信号通路主要分为4类：

l 线粒体通路：主要由多种压力信号，例如，DNA化学损伤，UV辐射，生长因子缺乏等引起，也称内源细胞凋亡通路；

l 死亡受体途径：由细胞表面的受体信号所介导，也称外源细胞凋亡通路；

l T细胞参与的细胞死亡途径：此通路中，颗粒酶A或颗粒酶B均可诱导凋亡；

l 内质网通路：当内质网的蛋白折叠功能受到影响时，未折叠蛋白反应（UPR）将会被激活，继而引发凋亡。

这四条信号通路既相互独立又互相交叉，其核心的执行者都是一类蛋白：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）。

细胞凋亡检测方法

1. 检测Caspase切割法

Caspase是一类与凋亡密切相关的蛋白水解酶家族，一般在细胞中以酶原形式存在，只有在凋亡情况下，才会发生蛋白切割而激活。所以通过检测Caspase的切割条带，来表针凋亡的发生。小编前面也讲到凋亡发生时，DNA会片段化，需要DNA修复酶来对DNA进行修补。PARP(poly ADP-ribose polymerase)就是一种DNA修复酶，它也是Caspase的切割底物，当它被切割时，同样能说明凋亡的发生。

2. 检测Bcl-2家族蛋白表达

线粒体凋亡途径可以通过Bcl-2家族蛋白来调节和控制。Bcl-2家族蛋白控制线粒体膜的通透性从而影响细胞色素c的释放，它们有的是促凋亡的，有的是抑制凋亡的，若促凋亡蛋白（Bax、Bad）表达量上升，同时抗凋亡蛋白（Bcl-2）Bcl-2表达量下降，也能说明凋亡发生。由于Bcl-2家族蛋白还参与其他通路，如细胞自噬通路。一般Bcl-2家族蛋白表达情况与凋亡其他检测指标同时使用，增加说服力。

3. 检测p53蛋白表达

p53是一种抑癌基因，其生物学功能是在G期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其凋亡。在依赖p53蛋白的细胞凋亡中，p53蛋白能特异性地抑制Bcl-2的表达，但对Bax的表达有明显的促进作用，在这些细胞中，p53的积累和活动引发了细胞凋亡。

4. 检测细胞色素c的释放

细胞色素c参与线粒体通路。随着凋亡的进行，细胞色素c会从线粒体中释放到细胞质中，所以检测时，细胞质中的细胞色素c会增加，线粒体中的细胞色素c会减少。

5. Annexin V和PI双染法检测细胞凋亡

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。Annexin V进行荧光素FITC标记后，可作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

6. TUNEL法检测细胞凋亡

细胞凋亡中，染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3'-OH 末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'-OH末端，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有 3'-OH 形成，很少能够被染色。TUNEL 实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，常用于组织的细胞凋亡检测。

通常情况下，需要联合使用多种检测手段增加说服力，如通过WB检测Caspase的自切割，对PARP的切割，Bcl家族蛋白的变化，通过流式检测细胞水平上的凋亡情况，通过TUNEL检测动物水平上的凋亡情况。