外泌体small RNA测序

    外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-100 nm，具有杯状形态、双层膜结构，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞（免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。Exosome可通过细胞膜受体直接激活受体细胞，也可运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至细胞器进入受体细胞，参与细胞间通讯。Exosome在免疫应答、炎症反应、血管生成、凋亡、凝血和废物处理等生理过程发挥关键作用，可作为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。

图1外泌体产生过程的示意图

一、实验流程

二、数据分析

a)     原始数据产出统计

b)    已知 small RNA注释：miRNA, siRNA, piRNA, rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, repeat asscociated sRNA等

c)     降解片段鉴定：mRNA, exon, intron等

d)    预测新的 miRNA

e)     miRNA同源性结构分析

f)     miRNA表达谱聚类分析

g)    miRNA差异表达分析

h)    miRNA靶基因预测

i)      靶基因功能注释、 Pathway和Gene Onlotogy富集分析

j)      与mRNA进行关联分析（需要有mRNA数据）

三、案例分析

外泌体联合细胞小RNA测序发现——导致细胞与外泌体小RNA组分差异的选择机制：3’核酸添加

Nontemplated Nucleotide Additions Distinguish the SmallRNA Composition in Cells from Exosomes. Cell Reports. 2014. IF=7.87

为研究细胞与其分泌的exosome中的小RNA组分差异的选择机制，研究人员分别对EB病毒感染的LCL（n=6）和BL(n=4)以及DLBCL(n=2)三种B细胞进行exosome分离，并对exosome与其对应的细胞进行总RNA提取，再对这6个文库通过Illumina HiSeq 2000进行small RNA seq。

结果发现某些RNA种类在细胞中富集而其他则在exosome中高表达，细胞中miRNA占小RNA的50%，而exosome中只占20%。miRNA最丰富的细胞其对应的exosome miRNA也对丰富，但exosome与细胞中的miRNA分布有明显差异；对三种细胞系miRNA根据差异倍数进行分类，发现最显著富集的miRNA位于exosome而细胞中没有检测到，qRTPCR得到进一步验证。说明miRNA并非随机掺入exosome。

miRNA形成过程中低效的Drosha或 Dicer酶会导致3’端长度变异。其他miRNA亚型由核苷酸转移酶介导的转录后修饰（非模板端NTAs）产生。全局分析miRNA 3’端变异体发现，3’长度变异体在细胞与exosome中分布一致，但3’ NTAs有显著差异：3’-A  miRNA相对富集在细胞中，而3’-U miRNA在exosome中过表达，从而说明3’核酸添加可能影响miRNA在细胞和其分泌的外泌体中的分布。

                 图1. 细胞与其分泌的外泌体中miRNA表达热图

四、样品要求

血清样品：2-4ml

外泌体样品：1ml

RNA样品：500ng