技术简介
DNA甲基化修饰是表观遗传研究的热点之一，我们通常认为DNA甲基化就是胞嘧啶甲基化（5-methylcytosine, 5mC），却不知道随着测序技术的快速发展，一种新的DNA甲基化修饰类型—DNA-6mA甲基化已经成为表观遗传学领域的研究热点。 

云序生物率先开发了DNA-6mA测序技术—6mA-IP-seq。其原理类似于MeDIP的免疫共沉淀测序技术，利用特异性抗体富集6mA片段，扩增后进行高通量测序及甲基化分析，以较小的数据量，快速、高效地绘制全基因组DNA甲基化水平的图谱。

 技术优势

一站式服务：

客户只需提供相关样品的基因组DNA，云序生物为您完成从6mA-IP富集，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程

优化的实验流程：

6mA-IP的富集效率是决定数据质量的关键，云序生物6mA-IP实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程，具有极高的效率和特异性

严格的质控：

实验的各个关键步骤进行严格的质控，全程监控实验质量，确保客户得到优质的数据

专业的生物信息学分析：

云序生物具有强大的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求

样本要求

样品类型：无降解且无RNA污染的DNA样品(适用所有有参考基因组的物种)。

样品需求量：不少于10ug

样品浓度：不少于50ng/ul

样品运输及保存：

样品运输：样品置于1.5mL Eppendorf 管中，封口膜封好，干冰运输，DNA可用冰袋运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块切块，液氮冻存后-80℃保存；DNA样品短期内可-20℃，避免反复冻融。

数据分析

1、DNA甲基化富集峰的识别

通过高通量测序和生物信息分析，识别甲基化富集的基因组区域，默认p <= 1e-5（具体参数以报告为准，云序生物会根据数据，适当调整参数）的峰为统计上显著的甲基化区

注：每个样品组做一个Input，以去除基因组背景，降低假阳性率

2、DNA甲基化区域富集峰的注释 

富集峰识别后，得到的是一堆基因组位置信息，通过生物信息分析利用最邻近基因对富集峰进行注释，并根据峰中点相对于已知基因的位置，将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰

3、DNA甲基化富集峰区域的在基因中的分布

4、差异DNA甲基化区域的鉴定（DMRs）与注释 

云序生物使用diffReps软件进行差异甲基化区（differentially methylated regions，DMRs）鉴定。默认p-value<0.0001，fold change >=2作为差异甲基化区的阈值

5、差异DNA甲基化区的GO（Gene Ontology）与信号通路分析

目的：对差异甲基化基因进行功能分类，并发现显著性富集的功能条目

6、DNA甲基化可视化

案例分析：

DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells.NATURE, IF: 44.958

作者以SMRT-ChIP、RNA-seq和6mA-IP seq三种技术相结合的方法研究小鼠基因组甲基化。研究发现小鼠胚胎干细胞中存在另一种DNA甲基化修饰—6mA甲基化；Alkbh1是腺嘌呤甲基化修饰的一种去甲基化酶，在Alkbh1基因缺失突变小鼠细胞中腺嘌呤甲基化水平增加，进而导致转录沉默。揭示了哺乳动物表观修饰的重要组成部分—6mA甲基化，在哺乳动物中发挥沉默基因表达的功能，而不是如其他生物体中激活基因表达的作用。

                      6mA分析                                           6mA与基因表达的关系

6mA-IP seq分析

N6-Methyladenine DNA Modification in Drosophila.Cell, IF: 31.398

作者以果蝇胚胎干细胞为材料，对其基因组中6mA修饰进行研究，发现在果蝇基因组中6mA修饰广泛存在，这种修饰受內源去甲基化酶DMAD调控，在胚胎发育过程中呈动态变化。进一步研究发现，DMAD酶作为果蝇胚胎发育所必须的一种酶，它作用于转座子的6mA位点，去甲基化后，转座子的表达受到抑制。该文章发现果蝇中DNA甲基化修饰新类型-6mA，并且初步探究了6mA甲基化的调控机制。

     6mA分布                                       mA体外去甲基化分析

6mA-IP seq与RNA-seq联合分析