技术简介

外泌体（Exosomes）是一种直径在40～100 nm的圆形单层膜结构，是细胞外泌囊泡中体积较小的一种。外泌体可被大多数细胞分泌，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液中。外泌体中不仅包含蛋白质成分，还包括一些RNA成分，如微小RNA ( microRNA，miRNA)、长链非编码RNA和mRNA、环状RNA（circular RNA，circRNA）。外泌体所携带的这些RNA统称为外泌体来源RNA，具有完整的序列结构和生物活性。

常规的转录组分析仅通过Oligo (dT) 法对mRNA进行富集和分析，会导致包括环状RNA和相当比例LncRNA的丢失，无法准确、全面地反映真实的转录组信息。云序生物外泌体全转录组测序服务采用去核糖体的建库方案，同时检测样品中mRNA、LncRNA和环状RNA，获得最全面的转录组信息，进而针对不同类型的RNA进行表达分析，结构研究，变异研究以及新转录本的发现。

云序优势
全面的检测所有类型的RNA：
常规的转录组测序采用Oligo d(T)法纯化带Poly(A)尾巴的RNA分子。然而很多热门的RNA分子，如环状RNA和部分LncRNA，没有Poly(A)尾巴，因此在处理过程中会被丢失掉。云序生物拥有市面上最全的，针对不同物种的去rRNA试剂盒，能够全面保留所有类型的RNA信息
适用于降解样品：
云序生物采用特有的，可适用于降解样品的试剂盒，能够最大程度的保留降解样品中的RNA信息。尤其适合于临床样品的转录组检测
链特异性检测：
很多基因位点会生成转录方向相反的、具有重要调控功能的反义RNA。常规的建库方法无法区分这些反义RNA，而云序生物采用链特异性的建库方法，可以准确检测反义RNA，从而提供更全面的转录组信息
一站式服务：
客户只需提供细胞，组织，体液或总RNA，云序生物为您完成从样品准备，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程
专业化的生物信息分析：
云序生物具有强大的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析要求
样本要求
样品类型：
组织、细胞、体液、总RNA。其它类型样品请详询。
样品量：

a）血清：5 mL

b）血浆：5 mL

c）细胞上清：20 mL

d）体液：

唾液：15 mL

鼻涕：15 mL

尿液：100 mL

脑脊液：10 mL

e）外泌体总RNA 4 μg （OD260/280≥1.8；OD260/230≥1.5; 无明显降解，电泳检测样品特征性条带完整清晰，无明显弥散或拖尾 ）

样品运输及保存：

样品运输：样品置于1.5mLEppendorf管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；血液样品应使用EDTA抗凝，不可用肝素；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。

数据分析 

1、差异表达mRNA/环状RNA/LncRNA筛选

根据高通量测序结果，筛选出（Fold Change≥2， P值≤ 0.05）差异表达mRNA/环状RNA/LncRNA。
注：Fold Change代表差异程度，P值代表差异的显著性，筛选中采用的倍数变化会根据具体数据情况进行调整。

2、差异表达mRNA/环状RNA/LncRNA的聚类

3、差异表达mRNA/环状RNA/LncRNA的GO和信号通路分析
对差异mRNA/环状RNA/LncRNA的来源基因进行功能和信号通路富集分析，以便推断mRNA/环状RNA/LncRNA的功能。

4、LncRNA-mRNA共表达网络（CNC网络）构建
利用LncRNA与mRNA的共表达关系，构建LncRNA-mRNA共表达网络图，帮助发现LncRNA的靶基因，并推断LncRNA的功能

5、竞争性内源RNA（ceRNA）分析
通过circRNA-miRNA相互作用网络分析，可以帮助解析作为miRNA海绵发挥作用的环状RNA的功能以及作用机制。

6、circRNA-miRNA-gene网络构建
一些LncRNA可以通过与miRNA结合，调节miRNA靶基因的表达。通过LncRNA-miRNA-mRNA关联分析，可以帮助推断作为miRNA海绵发挥作用的LncRNA以及作用机制。

案例解析
案例1：外泌体全转录组测序（云序客户文章）

原文：Circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice

期刊：Journal of Neurotrauma 影响因子：5.19

近期，天津医科大学总医院张建宁教授带领的神经创伤团队针对大脑创伤的研究。应用全转录组测序技术，仅通过大脑创伤外泌体中环状RNA表达谱研究发表了世界首个小鼠脑创伤模型外泌体环状RNA研究成果。作者首先分离了小鼠脑组织，提取脑周质外泌体，通过外泌体全转录组测序检测TBI脑周组织外泌体中环状RNA的表达变化。结果发现231个差异表达的环状RNA，其中155个上调，76个下调。接下来通过生信分析如GO及KEGG分析对外泌体差异表达的环状RNA进行了功能预测。GO分析表明这些RNA分子主要参与神经损伤修复，神经系统发育及神经信号传导相关，这些分子同时主要富集在cGMP-PKG信号通路。环状RNA-miRNA互作网络图揭示了环状RNA作用靶miRNA及可能的功能。本文首次研究了大脑创伤外泌体中环状RNA变化，为后续分子机理详细研究提供诸多靶分子，也为大脑创伤的干预治疗提供潜在的靶点。

图1. 创伤小鼠外泌体电镜及WB鉴定

图2.外泌体环状RNA表达谱

图3.外泌体差异表达环状RNA GO和KEGG分析

图4.外泌体差异表达环状RNA-miRNA网络图