【星森林生物】提供快捷高效的实时荧光定量PCR(Real Time PCR,RT PCR)服务，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 是一个常用的mRNA水平的基因表达定量技术。

服务内容

细胞/组织的基因差异表达检测，经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基 因在不同时段的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。

组织/细胞样品中基因拷贝数的确定，DNA或RNA的相对和绝对定量分析。

包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植 物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。

基因分型，基因突变及多态性方面的研究。

技术原理

Real-time PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和 标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

实时荧光定量PCR技术具有特异性强，有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，做到PCR每循环一次就收集一个 数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。

技术流程

一、RNA的提取

二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA

三、RNA琼脂糖凝胶电泳

四、RNA反转录为cDNA Real-Time PCR引物设计的要求

① Tm=55~65 ℃

② GC=30~80%

③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80~300 bp之间都可。 ④ 引物的退火温度要高，一般要在60 ℃以上。

五、cDNA与引物质量检测

选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。

六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：

常用的看家基因有β-actin，GAPDH，18S rRNA

七、定量PCR检测

八、扩增曲线和溶解曲线

溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平 台期。

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