CO-IP检测/WB检测/ChIP/免疫组化/免疫荧光

CO-IP检测

免疫共沉淀（Co-IP）主要原理是将纯化的抗体直接固定在琼脂糖基质上，从细胞裂解的液或其他复杂混合物中分离天然蛋白复合体。免疫共沉淀是研究蛋白：蛋白相互作用的一种常用方法，即利用抗体去免疫沉淀特定抗原（诱饵蛋白）并且共沉淀任何于该抗原相互作用的蛋白（目的蛋白）。

免疫共沉淀操作步骤

1、取 4℃保存的抗体固定柱，4℃ 1500 X g 离心 1min，弃滤液；

2、加入200μl IP裂解液洗涤离心柱，4℃ 1500 X g 离心 1min，弃滤液；

3、加入200μl预冷的 PBS洗涤离心柱，4℃ 1500 X g 离心 1min，弃滤液，于纸上吸干柱头液体，塞紧塞子；

4、加入（使用对照琼脂糖树脂预处理细胞裂解液：4）保存的滤液，拧紧盖子，4℃孵育3.5h；

5、安装收集管，取下并保留塞子，旋松盖子，4℃ 1500 X g 离心 1min，保留滤液；

6、加入200μl预冷的 PBS洗涤离心柱3次，4℃ 1500 X g 离心 1min，弃滤液；

7.安装收集管，向离心柱中树脂斜面加入10μl Elution Buffer，1500 X g 离心 1min，保存滤液；加入50μl Elution Buffer，室温放置5min，1500 X g 离心 1min，保存滤液。

WB检测

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

主要实验步骤如下： 

总蛋白提取

（1）组织剪切成细小的碎片。每100mg组织加入1mL RIPA裂解液。用玻璃匀浆器匀浆20次。 

 （2）将匀浆物转移到1.5 mL离心管。12,000rpm，4 oC离心5min，吸取上清，即可进行后续的电泳、Western或免疫沉淀操作。 

蛋白浓度测定（BCA测蛋白浓度）

检测样品的测定

检测样品测定时，同 BSA 标准品溶液同时进行测定。

（1）分别取100 μL检测样品（稀释100倍）加入到微孔板中，每个样品取2个平行样进行测定。

（如果必要，也可选择与BSA标准品溶液相同的稀释方法稀释检测样品后测定）                        

（2）加入100 μL工作液后，立即混匀。

（3）37℃水浴中反应60min后，冷却至室温。

（4）酶标仪波长设定在562nm 处进行测定。用水校零。尽可能在20min内检测完毕所有样品。

（5）各样品溶液的吸光度值减去Blank值的平均值，根据标准曲线计算出检测样品的蛋白浓度。     

SDS－PAGE电泳

（1）将长短玻璃板对齐后按照方向放入制胶夹中卡紧，然后垂直卡在制胶架子上准备灌胶。

（2）配制15％和10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将胶加至适量高度（绿线附近）后，轻柔加上双蒸水压胶。

（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用滤纸将水吸干。

（4）配制5％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

（5）待浓缩胶凝固后，将含胶的玻璃板加入电泳夹卡紧，放入电泳槽（电极红对红，黑对黑）。

染色质免疫共沉淀（ChIP）

染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是研究蛋白质与DNA相互作用的经典实验方法。它是基于体内分析发展起来的方法，能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。随着新一代测序技术的成熟与发展，整合了染色质免疫共沉淀与高通量测序技术的ChIP-Seq，是研究目标靶蛋白与DNA相互作用的又一技术突破，可应用于组蛋白特异性修饰位点、转录因子结合位点等的研究。

技术特点

全基因组覆盖： ChIP-Seq可在全基因组范围对蛋白结合位点进行筛选与鉴定

高灵敏度：每个样本可获得数百万条的序列标签，可发现研究基因组上稀有的蛋白结合位点

高精确率：可获得高水平的信噪比数据，准确区分真实事件与噪音，精确定位蛋白结合位点

高性价比：仅需较少的数据量即可鉴定全基因组范围内的结合位点

免疫组化（IHC）

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

免疫荧光

免疫荧光染色：主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，在激光共聚焦系统下即可观察到荧光。染色程序分为两步，第一步，用已知未标记的抗体（Anti LC3II）加到未知抗原样本上；第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体（Anti Alexa Fluor 647）。如果第一步发生了抗原抗体反应，荧光标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定抗原。

我公司可以提供单标、双标及三标的免疫荧光服务。

威斯腾实验服务流程

威斯腾生物服务项目