de novo基因组

全基因组

宏基因组

转录组

miRNA

宏基因组测序及分析

　　宏基因组测序，是将环境样品中的微生物群落基因组作为一个整体，进行高通量测序分析，从而对环境中微生物菌群的多样性、丰度以及功能活性进行解读，进而探求微生物与环境、微生物与宿主之间的关系；通过比较研究，发掘和研究新的、具有特定功能的基因等。

　　宏基因组测序，使我们对环境微生物的研究不再单纯局限于纯培养，可以对样品中不可培养微生物进行更为全面的了解与探究，大大扩展了微生物的研究范围，为微生物的研究提供了高效的研究工具。

　　我们的Illumina测序平台相对于454测序平台具有更高的性价比，在相同的投入的情况下，采用Illumina可以得到更高的数据量，这对于复杂的微生物群落而言意味着更高的覆盖度，这有利于鉴定低丰度的微生物群落，也有利于挖掘更多的微生物基因资源。

一、技术路线

　　图1 宏基因组研究流程

二、生物信息学分析

1. 物种多样性分析

　　将所得Reads质控后，与微生物基因组数据库进行比对，得到样品物种信息，分析出环境样品中各个物种在总样品物种中所占的比例。

　　图2 某环境样品中微生物群落组成结构饼图

2. 微生物群落功能基因分析

　　通过宏基因组大量测序，除了能得到样品中的物种分类组成信息，还可以将短片段序列组装得到contig，预测基因后进行功能分析，深度挖掘基因资源， 研究与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品间的比较，研究微生物群落内部、微生物与环境、微生物与宿主间的相互关系。对于不同的样品，可以进行相应 的比较分析，以发现样品间某些指标的异同。

　　图3 两个不同时间环境样品eggNOG 分析结果

　　图4 某环境样品KEGG pathway 分析代谢路径图

三、应用领域

人体及动物微生物：如人体皮肤、消化道、呼吸道、口腔以及动物瘤胃、昆虫肠道等；

环境微生物：土壤、污水、海洋、矿地、火山口等；

工业微生物：酿酒微生物、发酵微生物等；

植物内生菌等

四、常见问题解答

1. 宏基因组测序对于样品有什么要求？

答：1）对于基因组DNA样品，一般要求OD260/280在1.8-2.0之间，OD260/230大于1.0，浓度>30ng/μl,总 量>5μg，质检结果显示基因组DNA完整无降解。2）对于PCR产物，需经电泳割胶回收，要求产物浓度>10ng/μl，总 量>150ng，OD260/280在1.8-2.0之间。

2. 一般需要多少数据量？

答：对于不同的环境样品，因其物种组成和丰度的不同，所需的数据量也有较大差异，一般而言，对于全基因组测序需要3G左右的数据量，对于16S rRNA基因可变区测序一般需要8M reads的数据量。

3. 实验周期有多长？

答：从收到样品到文库制备再到高通量测序，一般控制在20个工作日内完成，基本生物信息学分析一般能在30个工作日内完成，中高级生物信息内容一般60个工作日完成。

五、相关文献

1. Elizabeth M Ross, Peter J Moate, Carolyn R Bath,et al. High throughput whole rumen metagenome profiling using untargeted massively parallel sequencing. BMC Genetics, 2012, 13: 53-66.

2. Zhu LF,Wu Q, Dai JY, et al, Evidence of cellulose metabolism by the giant panda gut microbiome. PNAS, 2011, 108(43): 17714-17719.

3. Qin JJ, Li YR, Cai SH, et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes. Nature, 2012, 490: 55-60.

4. Qin JJ, Li RQ, Raes J, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature, 2010, 464: 59-67.