Charm-Pure™ 精纯大量唾液 DNA 提纯试剂盒

室温运输和保存，Proteinase K 和 RNase A 保存在 4 ºC。

试剂盒组成及贮存

Charm-Pure™ 精纯大量唾液DNA提纯试剂盒可从 4 ML 唾液中提纯高质量的gDNA，其组成如下表，除了 Proteinase K 和 RNase A 需要保存在 4 ºC 之外，其余组分室温保存即可。可进行 50或者250 次唾液gDNA 的提 纯。

产品介绍：

Charm-Pure ™ 精纯大量唾液 DNA 提纯试剂盒专为从 4 ML 新鲜唾液、冻存唾液、Charm-Protect™ 或其他公司 唾液保存液中分离提纯高质量的唾液 gDNA 而设计，操作步骤简单迅速。昌美生物将固体表面可逆结合技术 （SSRB）和传统的核酸硅膜技术相结合，采用特别的结合管和改进的硅膜来选择性地吸附核酸，能有效处理 4 ml 的唾液混合液，高效率地提纯回收高纯度的唾液 gDNA。产量高，质量好！提纯的 gDNA 可直接用于下游各种实 验，如限制性酶切反应、SNP、序列分析、DNA 建库，NGS、全基因组扩增（WGA）和 DNA 甲基化分析等。

亮点：

操作简单：可处理 4 ml 唾液样品，避免多次处理小量样品，操作步骤简单，不需要特别的仪器。 质量可靠，回收率高：采用独特的固体表面可逆结合技术和改进的硅膜核酸结合技术，能最大程度的回收唾液样品 的 gDNA 。质量高，重复性好。

所需的额外材料

 无水乙醇、异丙醇

 1.5 ml 或 2.0 ml 离心管，15 ml 的的可离心管。涡旋振荡器、温箱，水浴锅或恒温金属浴。

 可离 1.5 ml 或 2.0 ml 离心管的离心机和可离心 15 ml 管的摇摆式离心机.

常规防范

 该试剂盒仅用于实验。

 实验操作时需穿实验服，戴一次性手套。避免摄取和吸入试剂，避免与试剂盒中试剂进行直接接触，一旦接 触，用水彻底冲洗。

 提纯核酸时，使用无菌新吸头避免污染。

实验前准备

1、 在进行从唾液提纯 gDNA 之前，需要根据提纯的样品数目制备新鲜的 Binding Buffer（KB6）工作液： 将 Binding Buffer（KB6）与异丙醇以 1：4 体积比混匀，如配制 500 µl Binding Buffer（KB6）工作液需 将 100 µl Binding Buffer（KB6）与 400 µl 异丙醇混合均匀得到。需要制备 Binding Buffer（KB6）工作 液的体积根据： （1）待提纯的样品数目；（2）预期的损失，在悬浮过程中，一般会有 10%的损失。每 100 µl 细胞裂解液需加 100 µl 含异丙醇的 Binding Buffer（KB6）工作液（1：1 体积比）。剩余的 Binding Buffer（KB6）工作液当天予 以丢弃。

2、 制备 Washing Buffer I（WB1）工作液：如果是 JM-279-M 试剂盒，加 22 ml 无水乙醇到 Washing Buffer I （WB1）中，充分混匀。如果是 JM-279-L 试剂盒，加 110 ml 无水乙醇到 Washing Buffer I（WB1）中，充分混 匀。在瓶上做好标记表示已加乙醇！室温保存，加乙醇的 WB1 在六个月之内使用。

3、制备 Washing Buffer II（WB2）工作液：如果是 JM-279-M 试剂盒，加 44 ml 无水乙醇到 Washing Buffer II （WB2）中，充分混匀。如果是 JM-279-L 试剂盒，加 220 ml 无水乙醇到 Washing Buffer II（WB2）中，充分 混匀。在瓶上做好标记表示已加乙醇！室温保存，加乙醇的 WB2 在六个月之内使用。

4、该试剂盒该可从 4 ml 唾液保存液中提纯 gDNA（2 ml 唾液 + 2 ml 唾液保存液）或冻存的唾液。在收集唾液时 候，为了避免 gDNA 降解，请遵守标准的 Charm-Protect™ 唾液 DNA 保存液收集和保存程序收集唾液。

操作指南

制备唾液细胞裂解液

1. 取 80 µl RNase A（RA2）到一个 15 ml 离心小管中。

2. 将储存在 Charm-Protect 唾液收集瓶中的唾液样品与唾液保存液颠倒 7-8 次后静置 3-5 分钟，让颗粒杂物沉 淀到瓶底。

3. 从唾液收集瓶中吸取 4 ml 唾液与保存液的混合物到预先加了 RNase A（RA2）的 15 ml 离心管中，将离心 管盖子盖上后颠倒 7-8 次，混合均匀。当吸取唾液混合物时，注意不要吸到收集瓶底颗粒状沉淀杂物。

4. 向管中加 80 µl Proteinase K（PK2），将离心管盖紧后颠倒离心管 15-18 次，充分和唾液混合均匀。

5. 将离心管置于 62 ºC ，温箱或者水浴锅或金属浴中温育 45 分钟，进行裂解，期间颠倒混合离心管，如有需 要，也可将样品在 52 ºC 温育过夜。（注意不是 62 ºC 过夜）。

6. 将离心管在转速 ≥ 2,250 x g 的摇摆式离心机里室温离心 10 分钟来去除颗粒物质，如食物颗粒、未经消化 的死细胞和纤维碎片。

Charm-Protect ™ 唾液保存液保存的唾液操作步骤 

如果您的样本是新鲜唾液、冰冻的唾液，或者是使用其他公司的唾液保存液保存的唾液，请使用以下步骤制备唾液 细胞裂解液：

1. 取 80 µl RNase A（RA2）到一个 15 ml 离心小管中。

2. 向管中加入 400 µl Lysis Buffer （PKLB）（PKLB 和唾液样品的体积比例是 1: 9）。

3. 将唾液样品颠倒 7-8 次后静置 3-5 分钟，让颗粒杂物沉淀。

4. 从样本中吸取 3600 µl 唾液或者唾液混合物，加到预先加了 RNase A（RA2）和 PKLB 的 15 ml 离心管中, 将 离心管盖子盖上后颠倒 9-10 次，混合均匀。（当吸取唾液时，注意不要吸到底部颗粒状沉淀杂物。）

5. 向管中加 80 µl Proteinase K（PK2），将离心管盖紧后颠倒离心管 15-18 次，充分和唾液混合均匀。

6. 将离心管置于 62 ºC 温箱，水浴锅或金属浴中温育 60 分钟，进行裂解，期间颠倒混合离心管，如有需要， 也可将样品放在 52ºC 温育过夜 （注意不是 62 ºC 过夜）。

7. 将离心管在转速 ≥ 2,250 x g 的摇摆式离心机里室温离心 10 分钟来去除颗粒物质，如食物颗粒、未经消化 的死细胞和纤维碎片。

结合 DNA 产物

1. 转移 3900 µl 澄清的唾液裂解液到一个 10 ml 结合管（BT4）中，注意不要吸到离心管底的碎片沉淀。

2. 加 3900 µl 含有异丙醇的 Binding Buffer（KB6）工作液到结合管（BT4）中，将结合管（BT4）盖紧后颠倒结 合管 15-18 次，充分混合均匀（注意：溶液充分混合非常重要）。

3. 将结合管（BT4）在转速 ≥ 2,250 x g 的摇摆式离心机室里温离心 10 分钟来结合 DNA 到管壁。

4. 直接将结合管中的液体倾倒入废液收集杯中，然后将结合管倒放在干净的吸水纸上面 3 至 8 分钟，使管内 液体尽量去掉。

5. 加 1200 µl Elution Buffer（EB2）溶液到离心小管，涡旋 1 分钟，62 ºC 温育 15 -20 分钟，再涡旋 1 分钟，使 沉淀完全溶解。

6. 加 720 µl Binding Buffer（GB5）到结合管内，将结合管（BT4）盖紧后颠倒结合管 7 - 8 次，混合均匀。

7. 向上述混合物中加 720 µl 乙醇，将管盖紧后颠倒结合管 15-18 次，充分混合均匀。（总体积是 2640 µl）

8. 将 660 µl 上述制备的混合物转移到配有收集管（Collection Tube）的离心柱（Spin-Column）中，共转移 2 次，分别到 2 套离心柱。室温下 8000 rpm（RCF = 5800 g）离心 1 分钟，让所有液体通过离心柱。

9. 取出 Spin-Column，将收集管中的滤液丢弃，将 Spin-Column 重新插回到收集管中。

10. 重复上述 8 和 9 步骤， 将全部溶液都通过 2 个离心柱。

清洗 DNA 产物

1. 向离心柱（Spin-Column）中加 500 µl 含有乙醇的 Wash Buffer I（WB1）。

2. 将带有收集管的离心柱（Spin-Column）以最大转速（≥13000 rpm 或 16000 g）室温离心 1 分钟，倒掉收集管 中滤液。

3. 向 Spin-Column 中加 500 µl 含有乙醇的 Wash Buffer II（WB2）。

4. 将 Spin-Column 以最大转速（≥13000 rpm 或 16000 g）室温离心 1 分钟，倒掉收集管中滤液。

5. 重复步骤 3 和 4，即用 Wash Buffer II（WB2）洗两次。

6. 以最大转速将带有收集管的 Spin-Column 离心 1 分钟来彻底去除含有乙醇的 WB2。丢掉收集管。将 SpinColumn 放入一个干净的 1.5 ml 离心管中。（在转移 Spin-Column 时，注意避免残留的 Wash buffer 接触到 Spin-Column 的尖端。）

gDNA 的洗脱

1. 根据需要洗脱的样品数量，取一定体积的 Elution Buffer（EB2）到 一个 1.5 ml 离心管中，置于 62 ºC 金属 浴 或水浴中加热。

2. 向 Spin-Column 的膜中央，加 150 µl 预热的 Elution Buffer（EB2），将带有离心小管的小柱置于 62 ºC 金属 浴温育至少 5 分钟。

3. 室温下最大速度离心 1 分钟，小柱下 1.5 ml 离心管中的滤液即为纯化的 gDNA。注意：如果有需要，可另 加 100 µl Elution Buffer（EB2）进行再次洗脱。这一步可增加产量 15 - 30 %，但提纯的 gDNA 因为体积增 大，终 浓度会降低。

4. 将来源于同一唾液样本洗脱的 DNA 样本合并。洗脱到离心管中的 gDNA 可直接用于各种下游反应，或者置 于 4 ºC 短期保存或 - 20 ºC 长期保存。