启因生物—PCR芯片技术操作流程 1.PCR芯片介绍 实时定量PCR是检测基因表达最灵敏、最可靠的方法。通过在试验过程中，实时监测荧光染料的信号变化可反映出样品中的基因拷贝数，并且实时定量PCR线性范围广（能达到5个数量级），因此可以检测同一样品中表达量极低的基因和表达量很高的基因。但是，由于实时定量PCR需要制备标准曲线和同时分析内参基因，因而每次实验只能检测少数几个基因的表达水平，若要检测大量基因，则工作量巨大，耗时长久。通过简单的以及经过优化的实时定量PCR体系，PCR芯片随之开发出来，研究者可以同时研究大量基因，既可以进行某些特别感兴趣的信号通路的研究，也可以作为验证芯片结果的方法，PCR芯片可广泛用于生命科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域，是近年生命科学领域的研究热点之一。 2.操作步骤 采用PCR芯片进行实验只需2小时。PCR芯片实验过程：首先将RNA样品反转录为cDNA第一链，作为PCR模板；接着，将模板加入到反应体系（ Real-TimeTM SYBR Green PCR Master Mix）中。在已经固定好基因特异性引物的96孔板各孔中，加入等量的PCR反应体系，进行PCR反应。采用仪器配套的软件计算PCR芯片中的每个基因的循环阈值（Ct）。最后，采用△△Ct方法比较对应的两个样本中同一基因的表达量变化。通过分析看家基因Ct值的一致性，可确定合适的标准化方法。芯片所设置的对照，可以检测PCR体系中是否存在DNA污染，或者是否有影响反转录或PCR实验步骤的因素存在。 3.技术难度 采用PCR芯片开展研究，技术上的难点是如何在同一次实验中，相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率，并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度，特异性和可重复性。因此首先设计筛选出最佳的候选引物，接着通过实验，在不同反应条件下，检测PCR反应体系与几千条PCR引物的组合，最终获得了优化的引物和PCR反应体系，适应PCR芯片的要求。 4.检测数量 根据一次实验所检测样品数量的多少，可将PCR 芯片分为低通量和高通量 PCR 芯片。低通量PCR 芯片的载体为96 孔或 384 孔 PCR反应板，仅须将制备好的样品cDNA加入相应的反应孔内，在荧光定量PCR 仪上进行扩增即可。在灵敏度方面，每次扩增仅需400 ng 总 RNA。但低通量PCR 芯片所检测的基因数量有限，而且无法进行多个样品的多个基因的并行检测。低通量PCR 芯片使用时和通常的定量 PCR 操作步骤相同，即从待检的生物样品（细胞、组织、血液等）中提取总RNA 或分离出 mRNA→经反转录形成cDNA→将所得的 cDNA 直接等量加入含有相应待检测基因引物的孔中→加入PCR mix→在荧光定量PCR 仪上进行 PCR 定量检测→数据分析。 高通量PCR 芯片是在固相载体上固定有成百上千个基因的特异性引物，并且可同时检测高达成百上千个样品，达到同时并行检测多个样品的多个基因表达的能力。因此，具有检测通量高、耗时短和样品用量少的优点。目前，由Applied Biosystems 公司研制的OpenArray SystemFluidigm 公司开发的BioMarkSystem将荧光定量PCR 技术与高通量芯片技术相结合，属于高通量PCR 芯片，但这些芯片必须在特定的定量PCR 仪器上使用进行。 5.优势 PCR芯片与常规PCR相比：1. 整体性，PCR芯片操作系统采用多基因扩增、结果分析一体化，操作简便；传统的PCR采用单基因扩增及结果分析，操作繁琐；2. 时间，PCR芯片检测多个基因的时间是过去PCR检测单个基因的时间；3. 试剂，传统PCR对试剂用量有要求，15微升以下就很难得到理想的扩增结果，PCR芯片可以扩增10微升以下的样品，这相应减少了试剂如Taq酶的用量，节省了实验经费也减少了废液污染。因此，与常规的PCR扩增技术相比，PCR芯片具有反应体积小、反应速度快、操作简便、价格低、样品用量少、无污染、节省试验成本、便于集成化、结果可靠的优点。 6.应用 使用PCR芯片技术进行基因表达（信号通路或多个相关基因）的检测，已普遍用于生命科学研究的多个领域，如疾病发病机制研究，并且PCR 芯片作为一种快速、准确的技术手段，可应用于药物机理研究中。 7.发展方向 PCR芯片不仅成本低，而且试样、试剂、人力三者消耗量均低， 速度也快， 灵敏度高。作为DNA分析的重要工序PCR，更是现代生物、医药不可或缺的部分，其没备的集成化，如样品预处理系统、分离系统以及检测系统等的集成使PCR芯片在生命科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域继续发挥重要作用。 8.启因服务技术 启因生物，自建优化的引物数据库，针对客户的需求，可以根据客户要求，任意选择基因，启因生物都可以进行引物反应条件的优化，从而达到同时检测多个基因的目的。因此PCR芯片技术服务利用就是SYBR Green荧光定量PCR技术，并在96或384孔板上同时检测一个信号通路或者一种疾病相关的84或372个基因的表达水平。 9.PCR芯片数据分析 1）384孔板展示区： 点击孔板列表中的某一项目时，中间的图像展示界面会出现384孔板，每一孔代表检测的一个基因，每个孔都有不同的颜色显示，越偏红的孔代表此基因的Ct值越高，越偏绿色的说明此孔基因的Ct值越低，颜色相近的孔说明这些孔的基因Ct值差异不大；有些孔板的孔是灰色，说明此孔没有基因。可以检测任意数目的样本和基因； 2）散点图多基因分析 在实验中，我们经常用到对两个样品的分析，因此就涉及到两个样品的Ct相关性分析，结果图表示两个样品中多个基因的Ct值情况，靠近X或Y坐标轴的说明此基因在某一样品中的表达较高，而处于中间的，即X/Y=1时，说明此基因在这两个样品中的表达无差异。 3） 标准品聚类分析 此种分析方式适用于多个样品多个基因的同时展示，类似于基因芯片，通过选择数据和对颜色、宽高度设置，一张关于qPCR结果的热点图完整的显示出来，而通过比较不同的格子，可以分析出表达是否存有差异，颜色相近的表示没有变化，颜色差异越大说明表达差异越大；