实时荧光定量 PCR

荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。与普通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点：1、封闭反应，无需PCR后处理。2、特异性强，灵敏度高。3、采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确。4、定量范围宽，可达到10个数量级。5、仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断。6、可实现一管双检或多检。7、操作安全，缩短时间，提高效率。荧光定量PCR是 通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

荧光定量PCR分类： 
☆TaqMan荧光探针
    PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5‘-3‘外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
 
☆SYBR Green荧光染料
    SYBR Green是一种DNA结合染料，能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中。从经济角度考虑，它也比其它的探针的价格要便宜得多。但由于它能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素，可以通过选择良好的引物并优化反应条件以消除非特异性影响。

●主要实验步骤如下： 

RT-qPCR是由三个步骤组成:
1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;
2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA;
3.检测:实时检测和定量扩增的产物.

具体实验操作步骤：

1. 设计并合成Realtime PCR引物。 
   2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR®； Green）的PCR反应的优化。 
   3. 客户样品RNA抽提 。
   实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。 
   实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA 。
   4. RNA质量检测  
   a. 紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度 。
   b. 使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。 
   5. 使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。 
   6. 制备标准曲线样品： 
   进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。 
   7. 标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中，进行RealTime PCR扩增和检测。 
   8. 检测结果进行标准曲线分析：以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。 
   9. 提供实验报告：包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表 。

荧光定量PCR中的一些术语

1. CT值：荧光信号有统计意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数，或者说是从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。
2. 阈值：阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
3. CT值与起始模板的量成线性关系。

客户需知：

• 请您提供新鲜的且尽量多的材料，或直接提供纯化好的总RNA或DNA（大于5ug/样本）。如是如织：100－200mg
• 请通过EMAIL提供已知的全长基因序列。Email:huameixinan@163.com
• 请提供详细背景资料：DNA/RNA来源，丰度。

结果提供：

• 实验详细步骤，和相关数据。
• 标准曲线，扩增曲线，溶解曲线。
• 完整的实验报告（含软件分析结果）