点突变

简介

      CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ Cas）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统，此系统是由II类CRISPR/Cas系统改造而来，能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中，进行有效的靶向编辑，具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。

      CRISPR/Cas9系统中sgRNA（short guide RNA）识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂，通过细胞内的同源重组修复方式，将外源供体DNA定点导入至基因组的靶位点中，从而实现基因敲入。

CRISPR/Cas9基因敲入示意图（Eric Murillo-Rodríguez et al., Sleep and Vigilance, 2018）

      将同时包含Cas9和gRNA序列的质粒载体与携带点突变的Donor载体（Oligo）共转入细胞核，Cas9和gRNA的复合物会引起靶位点DNA双链断裂，而后细胞以外源携带目标点突变的Donor作为模板进行同源重组修复，将目标点突变重组到基因组靶位点。Cas9和gRNA的质粒载体携带抗性基因，可进行药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出点突变纯合的阳性克隆。

图1.点突变方案

图2.点突变载体

服务流程

应用

      1、细胞疾病模型造模

            通过HDR，携带点突变序列的donor oligo (ssODN)替换WT对应的碱基。

      2、细胞疾病模型修复

            通过HDR，携带WT序列的donor oligo (ssODN)替换对应的突变碱基。

参考文献

      [1]Eric Murillo-Rodríguez, Rocha N B , André Barciela Veras, et al. The End of Snoring? Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing for Sleep Disorders[J]. Sleep and Vigilance, 2018, 2(1):1 3-21.