一、试剂盒组成、贮存、稳定性 说明书，耗材：DNA 制备管、小量滤器、2 ml 离心管、1.5 ml 离心管。 RNase A：50 mg/ml，室温保存。 Buffer G-A：裂解液，室温密闭贮存。 Buffer G-B：蛋白去除液，室温密闭贮存。 Buffer DV-A：Buffer DV 的制备液，请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制，室温密闭贮存。 Buffer DV：相分离液，室温密闭贮存。 Buffer BV：DNA 结合液，室温密闭贮存。 Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。 Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀，室温密 闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。 Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。 二、注意事项 Buffer G-A、Buffer G-B、Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜， 避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量水冲洗，必要时寻 求医疗咨询。 三、实验准备 1. 第一次使用时，在Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀。 2. 制备Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A，125 ml 异丙醇，75 ml 异丁醇，加入提供的250 ml 试剂瓶 中，混合均匀。 3. 4℃预冷Buffer DV。 4. 准备65℃水浴。 5. 使用前检查Buffer G-A 和Buffer G-B 是否有沉淀析出，若出现沉淀，请于65℃水浴加热至沉淀完 全溶解后再使用。 6. 将Eluent 或去离子水加热至65℃有利于基因组DNA 的充分洗脱。 四、操作步骤 从样品中提取基因组DNA 不同的样品采用不同的匀浆步骤。 【从动物组织中提取基因组DNA】 步骤1-3 请根据不同的实验条件选择对应的操作 使用研钵进行匀浆 1. 取1-20 mg 动物或人组织，移入冰水浴预冷的研钵中，快速、用力研磨成匀浆。 * 列组织请加液氮研磨至粉末状后，将研钵置于65℃水浴，当粉末开始融化时继续研磨1 min，匀浆后加入650 μl Buffer G-A 和0.9 μl RNase A，再进入步骤3 的操作下。 A. 富含DNA 酶的胰脏，脾脏，胸腺，淋巴等组织。 B. 富含胶原蛋白的皮肤、肌健等组织。 C. 富含角质蛋白的组织或坚硬的组织如骨骼等。 2. 加入650 μl Buffer G-A 和0.9 μl RNase A 后温和地研磨30 s。 3. 收集650 μl 研磨好的组织匀浆并转入2 ml 离心管。如匀浆体积不足650 μl，补充Buffer G-A 至650 μl，65℃水浴5 min。 【从植物组织中提取基因组DNA】 1.按下表称取适量的新鲜植物组织（如选用的是冷冻干燥的组织，则组织用量减半）。剪成小块放入研钵中；如从培养的植物细胞中提取基因组DNA，收集2×103-1×107 培养的植物细胞，10,000×g 离心1 min，加入150 μl 水充分悬浮细胞并转入研钵中，加入液氮，使组织冷冻完全后，快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止组织融化，研磨充分后将研钵放入65℃水浴至样品粉末刚开始融化。 * 表1 新鲜植物样品使用量按下表收集 植物花或叶片 10-100 mg 植物茎 ≤240 mg 植物根 ≤240 mg 植物种子 ≤240 mg * 如新鲜植物叶超过120 mg 或干植物叶超过60 mg，加入1300 μl Buffer G-A，匀浆后将样品分到两个2 ml 离心管中，然后按照步骤1-7 平行操作两管，第8 步和接下来的步骤合并到一管操作，以提高洗脱的DNA 的浓度。 * 样品研磨应充分，否则严重影响基因组DNA 的得率。 2. 加入700 μl Buffer G-A 和1.2 μl RNase A 贮存液，用力碾磨30 s。 3. 转移650 μl 研磨好的匀浆至2 ml离心管中，如匀浆体积不足650 μl,补充Buffer G-A 至650 μl，65℃水浴15 min。 * 富含纤维的根/茎等组织或富含淀粉、蛋白质的种子等样品，可延长水浴时间至60 min。 【从培养细胞中提取基因组DNA】 步骤1-2 应根据培养细胞的类型来操作，若从植物细胞中提取基因组DNA，请按步骤(从植物组织中提取基因组DNA)来匀浆 A. 悬浮培养的动物细胞或新鲜分离的动物组织单细胞悬液 1A. 用2 ml 离心管收集1×103-2×106 细胞悬浮液，2,000×g 离心5 min，弃尽上清。 2A. 加入150 μl 去离子水或PBS 悬浮细胞，加入500 μl Buffer G-A。 B. 单个细胞培养或96孔培养板、24 孔培养板、12 孔培养板和6孔培养板细胞培养 1B. 尽可能的丢掉上清液，加650 μl Buffer G-A 到每孔中，室温静置1 min。 2B. 用吸头来回吸注几次，转移650 μl 匀浆至2 ml 离心管，如匀浆体积不足650 μl，补足Buffer G-A 至650 μl。加入0.8 μl RNase A,旋涡振荡15 s，室温静置1 min。 【从酵母中提取基因组DNA】 1. 收集2×106-5×107 酵母细胞，10,000×g 离心 1min。用150 μl 水悬浮酵母细胞并转移至研钵中，加入液氮，待样品被完全冷冻后，快速、用力研磨至粉末状。将研钵放入65℃水浴至样品粉末刚开始融化时进入下一步操作。 * 当OD680 为1 时，酵母浓度为3×107 细胞/ml。 * 酵母细胞壁较为坚韧，应适当延长研磨时间和研磨次数以确保充分破碎酵母细胞壁。 * 研磨时应及时加入液氮，防止样品在研磨时融化。 2. 加入600 μl Buffer G-A 和1.2 μl RNase A 贮存液，快速用力碾磨30 s。 3. 转移650 μl 研磨好的匀浆至2 ml 离心管中，如匀浆体积不足650 μl，补充Buffer G-A 至650 μl，65℃水浴10 min。 【两相分离去除蛋白和其它杂质】 4. 加入400 μl Buffer G-B 和1 ml Buffer DV（4℃预冷），用力混合均匀。12,000×g 离心2 min。 * 请在实验前按照实验准备步骤2 准备Buffer DV. 5. 尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1 ml 4℃预冷Buffer DV，用力混合，12,000×g 离心2 min。 【基因组DNA 的纯化】 6. 丢弃上相，将下相转移至滤器（滤器置于2 ml 离心管中），12,000×g 离心1 min。 * 上相无需完全弃尽，在转移无色下相时偶有混入的上相，可在Tip 头内迅速分相，便于丢弃。 * 如在转移过程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可过滤除去。 * 有色上相务必除尽，否则将抑制DNA 结合到silica 膜上。 7. 弃滤器，在滤液中加入400 μl Buffer BV，混合均匀。 步骤8-11，可选择离心法或负压法 A．负压法 8A. 将DNA 制备管插到负压装置的插口上，将步骤7 的混合液移到制备管中，开启并调节负压装置至-20-30 英寸*柱。 9A. 保持负压，加入500 μl Buffer W1,吸尽管中液体。 10A. 保持负压，加入700 μl 已加入乙醇的Buffer W2，吸尽管中液体；已同样的方法再用700 μlBuffer W2 洗涤一次。 * 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 沿管壁加入Buffer W2 有助于彻底冲洗附在管壁上的盐分。 * 两次用Buffer W2 冲洗能确保盐分被完全消除，消除对酶切反应的影响。 11A. 将DNA 制备管放回2 ml 离心管中，12,000×g 离心1 min。 B．离心法 8B. 将DNA 制备管置于2 ml 离心管中，将步骤7 中的混合液移至制备管中，12,000×g 离心1 min。 9B. 弃滤液，将制备管置回到原来的2 ml 离心管中，加入500 μl Buffer W1，12,000×g离心1 min。 10B. 弃滤液，将制备管置回到原来的2 ml 离心管中，加入700 μl Buffer W2，12,000×g 离心1 min，以同样的方法，用700 μl Buffer W2 再洗涤一次。 * 确认Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。 * 再次用Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。 11B. 弃滤液，将制备管置回原来的2 ml 离心管中，12,000×g 离心1 min。 12. 将DNA 制备管置于另一洁净的1.5 ml 离心管中，在silica 膜中央加100-200 μl Eluent 或去离子水，室温静置1 min，12,000×g 离心1min 洗脱DNA。 * 将去离子水或Eluent 加热至65℃将提高洗脱效率。