Cre-LoxP重组酶系统载体构建服务

Cre-LoxP系统
Cre-Loxp系统策略是进行基因组定点突变的新途径，可在DNA的特定位点上执行敲除、插入、激活、倒转及易位等。该系统在80年代被引入后，已被成功的应用于酵母菌、植物、哺乳动物细胞培养及小鼠身上。Cre-LoxP系统包括Cre重组酶和Loxp位点两个部分。
Cre重组酶是整合酶家族的一员，1981年从大肠杆菌噬菌体P1中发现，是最常用的位点特异性DNA重组酶。Cre基因有1029个碱基，Cre重组酶由343个氨基酸组成（约38kD），它不仅具有催化活性，而且跟限制酶相似，识别特异的DN A序列，如：loxP位点，引起重组。Cre重组酶有70% 的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。
loxP位点是Cre重组酶作用的特异性重组位点，由两个13 bp的反向重复序列和8 bp的间隔序列构成，长34 bp，具体序列如下：5’一ATAACTTCGTATA一GCATACAT一TATACGAAGTTAT一3’ / 3’一TATTGAAGCATAT 一CGTATGTA一ATATGCTTCAATA一5’。 两个反向重复序列是Cre的识别序列，中间的间隔序列是重组发生的位置，同时也决定了loxP位点的方向，根据loxP序列的排列方向产生不同的重组结果。

图1. Cre重组酶结合loxP的位点

Cre-loxP系统的原理
Cre-loxP系统存在以下几种诱导重组的方式，这是基于Cre重组酶与loxP位点的相互作用而实现的。当基因内存在loxP位点且有Cre重组酶存在时，Cre重组酶便会与loxP位点两端的反向重复序列区结合形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合，进而形成四聚体。随之，loxP位点之间的DNA序列被Cre重组酶切掉，切口通过DNA连接酶重新连接。DNA重组结果主要取决于loxP位点的方向及位置
Cre重组酶介导的两个loxP序列间的特异性重组根据序列位置和方向的不同分为三种 情况：①当两个loxP序列位于同一条DNA链且方向相同时Cre重组酶能够敲除两个loxP序列间的DNA片段；②当两个loxP序列位于同一条DNA链且方向相反时，Cre重组酶能够反转两个loxP序列间的DNA片段；③当两个loxP序列位于不同DNA链上时，Cre重组酶能够介导loxP序列间DNA链的交换或染色体易位。Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程。

图2. Cre-loxP系统诱导重组的方式

Cre-loxP系统的优点

1. 高效性；

2. 时空特异性；

3. 应用范围广。

• 条件性基因敲除小鼠的构建

1. 转基因动物依赖的基因敲除

1. 利用原核注射的方法获得转基因“Cre小鼠”。在Cre基因上游加入特异性启动子，利用启动子控制Cre重组酶的表达；
2. 在胚胎干细胞（ES）中通过置换型载体进行同源重组，向基因组靶位点引入选择标记基因，并在其两侧引入两个同向排列的Loxp位点。两条同源染色体都带有 Loxp位点且引入的Loxp位点不能干扰靶基因的转录。将该ES细胞打入假孕母鼠中，发育成“floxed小鼠”；
3. “Cre小鼠”和“floxed小鼠”交配，Cre重组酶会在特定组织细胞表达，并切掉Loxp位点之间的靶基因和1个Loxp位点，从而达到靶基因的失活或敲除。

2. 病毒依赖的基因敲除

1. 通过转基因动物办法获得“Cre小鼠”或“floxed小鼠”；
2. 注射Cre病毒进loxP转基因小鼠体内，或者注射loxP病毒到Cre转基因小鼠体内，引入Cre或loxP元件。

1. 对Cre元件的改造：在Cre元件的C端接上雌激素受体（ER）的配体结合结构域，为了避免体内雌激素的干扰，可对雌激素受体的配体结合区做一定程度的改变，使其只能和某些雌激素衍生物相结合。目前使用最多的是Cre-ERT2突变体，融合蛋白Cre-ERT2不能入核，定位在胞浆内，当雌激素衍生物tamoxifen结合到Cre-ERT2受体结合结构域后，蛋白才会通过构象变化从锚定蛋白HSP90上解离下来，进入细胞核，识别loxP位点并发生重组。通过控制tamoxifen的注射时间，就可以调控基因重组的时间特异性。

2. 对loxP元件的改造：loxP元件也可以在间隔区和回文序列进行突变，不同的碱基选择就造就了不同的lox位点，常见的有 lox2272、lox511、lox5171、loxN和loxP等。突变后的loxP序列和同样突变的loxP序列匹配，才能被Cre重组酶识别和重组，而不能和未突变的loxP序列匹配，这样就可以将不同的loxP序列组合用于控制多个基因，在Cre重组酶的作用下，实现多个基因的重组。Brainbow技术就是根据loxP序列的改造而实现的。

3. 四环素诱导型tetO-Cre：将四环素调控系统与Cre-loxP系统相结合，需要用两种转基因小鼠交配使用。一种是由四环素响应启动子元件（TRE, 也叫 tetO）控制的Cre工具鼠（TRE-Cre, 也叫tetO-Cre）；另一种是由组织特异性启动子驱动的表达四环素转录活化因子 tTA 或 rtTA的小鼠。tTA或rtTA与tetO的结合受四环素或其衍生物强力霉素（Dox）的调节。tTA在没有Dox的时候与tetO结合诱导Cre表达，有Dox的时候不能与tetO结合，Cre不表达；rtTA与tTA相反，有Dox的时候与tetO结合，诱导Cre表达，没有Dox的时候与tetO不结合，Cre不表达。因此可以通过Dox来调控Cre在特定时间及特定组织细胞中的表达，从而介导基因重组。