技术简介
mRNA测序直接对特定样品在某一状态下产生的所有mRNA进行高通量测序，在获得基因表达信息的同时，还能够推测mRNA结构、识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性）、解析RNA编辑等，从而获取更全面的转录组信息。

云序生物mRNA测序服务针对不同样品类型采用差异化的技术策略，不仅能够检测常规样品，还能够检测降解样品和微量样品。客户可以根据样品情况，灵活选择。此外，云序生物还拥有独特的疾病和基因功能数据库，可以深入分析与特定疾病或信号通路相关的基因的表达、可变剪切以及突变等，从而帮助客户从海量数据中快速找到与自身研究背景相关的候选基因。

云序优势
适用于降解样品：
大部分公司采用低成本Oligo d(T)法富集mRNA，由于降解样品中的mRNA会丢失Poly(A)尾巴，因而无法被检测到。套餐2采用特有的，适用于降解样品的去rRNA试剂盒，能够最大程度地保留降解样品中的mRNA信息，尤其适合于临床样品的mRNA检测。
适用于微量样品：
套餐3采用商业化单细胞试剂盒，可以检测低至单细胞量（~10 pg RNA）样品中的mRNA。
独特的疾病和信号通路数据库：
收集了与癌症、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等人类重大疾病相关的基因，并详细注释了这些基因参与的信号通路，可以根据客户的研究领域，对mRNA测序数据进行更加个性化的整合和筛选。
一站式服务：
客户只需提供细胞、组织、体液或总RNA，云序生物为您完成从样品准备，文库制备，上机测序到数据分析的整套服务流程。
专业的生物信息学分析：
云序生物拥有强大的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求。
样本要求
样品类型：
组织、细胞、体液或RNA样品。其它类型样品请详询。
样品量：

a) 细胞：2×10⁷

b) 组织：100 mg

c) 体液：全血、血清、血浆2-3 ml

脑脊液：5 ml

尿液：50 ml

d) 总RNA：2 μg (OD260/280≥1.8；OD260/230≥1.5; 无明显降解，电泳检测样品特征性条带完整清晰，无明显弥散或拖尾) 

样品运输及保存： 

样品运输：样品置于1.5mL管中，封口膜封好，干冰运输。 

样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；血液样品应使用EDTA抗凝，不可用肝素；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。
数据分析 

1、差异mRNA筛选与聚类
筛选（Fold Change≥ 2,  P值≤ 0.05）两组或多组样品间差异表达的mRNA倍数变化。
注：Fold Change代表差异倍数，P值代表差异显著性，筛选中采用的倍数变化会根据具体数据情况进行调整

2、特定疾病或通路的个性化筛选
整合mRNA测序数据与云序生物特有的疾病和信号通路数据库，发现与特定疾病或通路相关的差异mRNA、可变剪切或cSNP。

3、差异mRNA的GO和信号通路分析

进行差异基因GO功能富集分析，以推断差异基因参与的生物学功能。

4、基因富集分析（GSEA）
寻找与样品表型相关的功能基因集合（gene set，包括信号通路或其他基因集合）。

5、基因共表达网络分析
根据基因间的表达相关性，构建共表达网络，以推断未知的基因功能。

6、基因互作网络分析
确定差异基因间的相互作用关系，筛选起关键作用的核心基因及其相应的靶基因。

7、基因表达水平累积曲线
展示每个样本不同表达强度的基因数目，揭示表型对基因表达的整体影响。

案例解析
案例1：通过RNA测序解析慢性淋巴细胞白血病的分子特征
原文：Transcriptome characterization by RNA sequencing identifies a major molecular and clinical subdivision in chronic lymphocytic leukemia

期刊：Genome Research 影响因子：10.10
本文通过RNA测序对慢性淋巴细胞白血病（CLL）样品和正常B淋巴细胞样品的转录组进行了深入的分析，找到了几千个差异表达的基因。此外，有两千个基因呈现出CLL特异性的可变剪切模式，但它们大部分在CLL中并没有发生表达量的变化。另外，作者还分析了CLL特异性的cSNP和基因融合。通过聚类分析和MDS分析表明：根据基因表达数据可以将CLL样品分成2个不同的子类，这两个不同子类中的病人的生存时间具有显著性差异。

图1. CLL特异性的可变剪切 

图2. 体细胞突变的等位基因特异性表达 

图3. MDS分析可以根据基因表达水平将CLL样品分成C1，C2两个亚型