类器官是在体外使用干细胞、祖细胞、肿瘤细胞等培养的三维细胞结构，具有空间有序的组织结构，类似于某些组织。2021年，类器官技术被列为中国“十四五”规划的重点研发方向之一。作为疾病模型，类器官相比传统的2D疾病模型提供了一个更加生理相关的环境，有助于阐明疾病的进展、稳态、发病机制等方面。它们有望在细胞治疗、药物开发、遗传工程、免疫学、组织再生等多个领域发挥重要作用。

图：类器官的应用指南

类器官主要是在适宜的培养条件下，由成体干细胞或肿瘤样本体外培养构建的。类器官的培养系统包括组织消化、清洗、处理、培养基准备、细胞与基质凝胶混合、培养、观察等步骤。其中，细胞悬浮液与细胞外基质（基质凝胶）的混合是关键步骤之一，为类器官提供了三维生长的基质。

基质凝胶的主要成分包括层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）、nidogen，以及TGF-beta、EGF、IGF、FGF、组织纤溶酶原激活剂等生长因子，这些生长因子在EHS肿瘤中天然存在。它为组织和细胞提供了支持、拉伸强度和支架支持。由Arcegen Biology开发和生产的Arcegel Matrix Gel不含LDEV（乳酸脱氢酶升高病毒），内毒素含量超低，并且经过彻底的支原体检测以确保无污染，包括不同类型如基础浓度、高浓度、低生长因子浓度等的基质胶。
 

应用方向

 小鼠小肠类器官构建

实验步骤

1. 样本准备：通过颈椎脱位法对小鼠实施安乐死，表面用酒精喷洒消毒。在无菌条件下，使用镊子摘除位于胃近端3~15厘米长度的肠组织，仔细去除肠系膜和脂肪。将摘除的组织放入含有1%抗生素、预冷至4°C的DPBS溶液中。

2. 样本清洗：使用注射器将肠管冲洗2-3次，然后用手术剪刀小心打开肠管，使粘膜面朝上露出腔面。用手术刀轻轻刮除粘膜表面的肠绒毛，直至组织变得透明。然后在新的含有DPBS的培养皿中再冲洗2~3次。

3. 初始样本处理：将洗净的小肠组织切成约2毫米宽的小片，转移到新的50毫升离心管中。用DPBS轻轻冲洗组织3-5次，以去除肠绒毛细胞和漂浮的脂肪组织。

4. 样本消化：将洗净的小肠组织碎片在含有3-5mM EDTA的预冷DPBS中消化，在4°C下摇动约30分钟。在孵化期间每10分钟轻轻摇动离心管。

5. 消化后，倒掉含有EDTA消化液的上清液，用新鲜的DPBS轻轻冲洗组织2~3次，以去除残留的EDTA。

6. 在小肠组织碎片中加入10~15毫升含有0.1% BSA的预冷DPBS。通过反复移液和悬浮将隐窝从基底层分离。在显微镜下检查少量悬浮液，当观察到大量隐窝样结构时停止移液。将移液后的组织悬浮液通过70μm滤网过滤，收集过滤后的组织悬浮液。

7. 重复步骤5-6两次，以1500转/分钟的速度在4°C下离心3分钟。

8. 混合物形成：在Arcegel基质胶中重新悬浮隐窝组织沉淀。每10μL基质胶悬浮液中含有200~600个隐窝。悬浮后将混合物放在冰上，并尽快处理以避免凝胶形成。注意：基质胶的稀释比例应≥50%，以确保培养过程中Arcegel基质胶结构的稳定性。

9. 将混合悬浮液种植在24孔板底部中心，每个孔约30~50μL，避免悬浮液与板壁接触。

10. 将培养板放入37°C的二氧化碳培养箱中培养约30分钟，直到基质胶固化。

11. Arcegel基质胶完全固化后，沿孔壁慢慢加入预先准备好的肠道类器官培养基，每个孔800μL。

12. 将24孔板放入37°C的二氧化碳培养箱中。每3天更换一次新鲜培养基，并监测类器官的生长状况。通常，小鼠小肠类器官在5~7天内形成。
 

实验结果

Day0  

  Day3

Day5

Day7

图：小鼠小肠类器官的体外培养结果

常见问题解答

1. 组织消化应该使用哪种消化液，消化时间应该是多长？
组织消化可以使用EDTA或胶原酶。EDTA适用于小肠和胃等空腔器官，而胶原酶有多种类型，可以与DNA酶联合使用，适用于更广泛的组织类型。消化时间根据组织类型而有很大差异，从几分钟到几个小时不等。

2. 处理基质凝胶时应采取哪些预防措施？
所有操作都应在无菌条件下进行，使用预冷的移液枪头以确保基质凝胶处于均匀状态。

3. 基质凝胶应如何分装、冷冻和使用？
解冻后的Arcegel基质凝胶可以分装到多个小管中，这些管子应该预先冷却。分装后应迅速冷冻并储存，以避免反复冻融。

4. 在不同孔板中培养类器官需要多少体积的基质凝胶和培养基？
培养类器官通常使用24孔板，每个孔使用50μl基质凝胶，然后加入500-800μl培养基以覆盖凝胶滴。在96孔板中，每个孔使用10μl基质凝胶，然后加入200μl培养基。对于6孔板，每个孔可以种植多个50μl的凝胶滴，然后加入2-3ml培养基以覆盖凝胶滴。
 

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