WB实验流程 样本制备的步骤 关于样本采集和保存，蛋白提取的相关 知识和技巧请查看： 接下来，让小编带您总结关于蛋白定量和蛋白变性相关的知识点： 一 蛋白定量 测定蛋白常用的方法有Bicinchoninic acid (BCA)法、Lowry法和Bradford法（考染法） 1. BCA法的测定原理是蛋白质将铜离子还原成亚铜离子，后者在碱性溶液中与BCA结合生成紫红色结合物，该复合物在562nm处有吸光值且与蛋白质浓度成正相关性，据此可测定蛋白质浓度。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。 2. Lowry法又称为Folin-酚试剂法，首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin-酚上级），产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745~750nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅（吸收值）与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量。 3. Bradford法又称为考染法。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。考马氏亮蓝G-250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。 三者之中，Lowry法与BCA同属化学法，Lowry法是药典中使用的蛋白浓度测定方法，但是操作繁琐，实验时间长。BCA法操作简单，时间短，形成的颜色复合物稳定性强，但可能受一些杂质影响。Bradford属于染料结合法，也易受到去垢剂影响。 二 蛋白变性 蛋白变性常用方式是高温煮样，煮样条件设置为100℃，根据样品量的多少，设置时间5~15min，煮样时间过长，一些蛋白可能会产生聚集性沉淀。疏水性极强的蛋白质，如含有多个跨膜结构域的蛋白质，在煮沸时可能会发生聚集或寡聚化，因此，其煮样条件为40℃~55℃条件下，温浴10~60min变性。煮样后的样本于-20℃或-80℃保存。 提取并定量后，并未加Loading Buffer煮样的蛋白样品，保存于-80℃时，防止反复冻融，并尽量于1周内加Loading Buffer煮样处理，最好不要超过2周。 在此，为了帮您更好地完成实验，我们推荐索莱宝蛋白定量和蛋白变性相关的配套产品。 产品名称 产品货号 Bradford法蛋白浓度测定试剂盒 BCA蛋白浓度测定试剂盒 Lowry法蛋白浓度测定试剂盒 4×蛋白上样缓冲液 （含DTT） 4×蛋白上样缓冲液 （含巯基还原剂） 4×非变性蛋白上样缓冲液
教你成为平淡无奇的WB实验小能手—样本制备篇
作者：北京索莱宝科技有限公司 2021-01-29T10:17 (访问量:4840)
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