本期解读
题目：iTRAQquantitative proteomic analysis reveals lipid metabolism pathway of N+ion-implanted C. pyrenoidosa cultivated in municipal wastewater
期刊：RenewableEnergy
影响因子：6.274
合作技术：iTRAQ定量蛋白质组学
一、研究背景
利用城市污水培养产油微藻可有效降低废水处理和生物柴油生产成本，成为微藻生物柴油研究的热点。用于生物柴油生产的理想藻类物种应表现出几种有利的特性，包括高脂质含量，高光合速率，快速生长速率和强抗性。开发获得工程化高质量藻类的方法是促进微藻生物能源产业可持续发展的关键。离子注入技术是微生物诱变和繁殖的一种广泛使用的方法。但是，这种方法很少用于藻类育种。在作者的初步研究中，通过N+离子注入以诱导小球藻突变，从而显著提高了小球藻的脂质生产率。在本研究中，作者使用iTRAQ技术定量了小球藻的原始菌株和突变菌株之间差异表达的蛋白质，并分析了这些蛋白质的功能。此外，对差异表达蛋白进行了生物信息学分析，以阐明离子植入促进小球藻突变的分子机制。
二、技术路线
三、实验结果
1、蛋白质的提取和质控
为了验证本研究中测试的目标蛋白是否可靠，首先进行了Bradford蛋白定量。随后，进行了12％的SDS-PAGE凝胶电泳，以确定本研究中提取的蛋白质是否已降解。定量结果（表1）和电泳图谱（图1）显示，样品蛋白质条带清晰完整，表明该蛋白质没有降解，所获得的蛋白质样品可用于后续的iTRAQ定量分析。
表1 小球藻的原始菌株（CVW）和突变菌株（CVM）样品蛋白浓度
图1 小球藻的原始菌株（CVW）和突变菌株（CVM）SDS-PAGE电泳图谱
2、差异表达蛋白质功能的注释
通过iTRAQ定量技术在小球藻细胞中总共鉴定出17种差异表达的蛋白质，包括3种上调的蛋白质和14种下调的蛋白质。对在CVW和CVM之间鉴定的上调和下调的差异表达蛋白进行了独立的功能注释。17种差异表达蛋白的GO注释结果如图2所示。与生物过程密切相关的蛋白质主要被鉴定为参与细胞和代谢过程的蛋白质。通过将在CVW和CVM之间鉴定到的差异表达蛋白质与COG数据库进行比较，我们可以预测其可能的功能并根据其功能类型对这些蛋白质进行分类，如图3所示。大多数蛋白质与“碳水化合物转运和代谢”或仅与一般功能预测有关。其他一些常见的功能蛋白包括参与“辅酶转运和代谢”，“翻译，核糖体结构和生物发生”和“细胞骨架”的蛋白。
图2 17种差异表达蛋白的GO注释结果
图3 差异表达蛋白的COG功能注释结果
3、差异蛋白功能分析
使用iTRAQ技术，在野生型和突变藻类细胞中总共鉴定出17种差异表达的蛋白质。如表2所示，其中3个是3个上调的蛋白，而14个是下调的蛋白，对差异表达蛋白的功能进行分类后，我们发现它们主要分布在催化酶、ATP/GTP结合蛋白、转运蛋白和未知蛋白质中。
表2 差异表达的蛋白质
小球藻是一种可以进行光合作用的真核微藻。它可以将光能、二氧化碳（CO2）和水转化为化学能，以碳水化合物分子的形式存储在微藻细胞内。小球藻细胞脂质代谢途径的示意图如图4所示。小球藻细胞的中心碳代谢网络主要由卡尔文循环，糖酵解，PPP和TCA循环组成。卡尔文循环主要提供GAP；糖酵解途径提供乙酰辅酶A，DHAP，ATP和NADH用于TAG的合成；而PPP提供了NADPH还原所需的脂肪酸合成能力；TCA提供ATP。
图4 小球藻脂质调节代谢途径的推定模型
在CVW和CVM藻类细胞之间鉴定出的大多数差异表达蛋白都属于ATP/ GTP结合蛋白，与能量流密切相关，这些蛋白质中的一些是催化酶。chiL基因编码的Mg-protopoyrin IX chelatase在突变细胞中被上调了2.85倍。该蛋白是叶绿素合成分支反应中的关键酶，有利于叶绿素的合成，从而可以提高光合作用效率，改善微藻细胞中的碳固存效率。
基因CHLNCDRAFT_59826编码的FBA蛋白在突变细胞中被下调了0.32倍。FBA是糖酵解途径和卡尔文循环中的关键酶，下调阻碍了糖酵解过程中FBP的裂解反应，以及卡尔文循环中以GAP为底物的代谢反应。基因CHLNCDRAFT_48880编码的TK蛋白下调了0.39倍。TK蛋白在PPP和卡尔文循环中起着重要作用。下调分别阻碍了PPP和卡尔文循环中两个反应的进行。在卡尔文循环中，FBA和TK的下调将导致GAP在微藻中积累。GAP主要用于合成葡萄糖或进入糖酵解过程后产生丙酮酸，两者均伴随着能量的产生。FBA的下调会阻碍FBP在细胞中的裂解反应，因此，通过卡尔文循环从GAP合成的葡萄糖现在主要在通向PPP的途径中形成G6P。
同时，GAP进入糖酵解过程，GAP底物浓度的增加有助于改善糖酵解过程，从而导致脂肪酸合成的两种前体乙酰辅酶A和3-磷酸甘油酸的不断积累。在PPP上，TK的下调将严重阻碍GAP内部的两个可逆反应。在这种情况下，来自糖酵解中间体G6P的氧化产物RuBP在随后的非氧化阶段将形成R5P和Xu5P。G6P底物浓度的积累有利于沿PPP的反应。PPP的增强将导致R5P的积累，R5P主要用于在藻类细胞分裂过程中合成DNA前体核苷酸，为藻类细胞的数量增加提供了遗传物质基础。此外，强化的PPP将产生大量的NADPH，可用于合成脂肪酸。
四、小结
离子注入诱变可以通过上调Mg-protopoyrinIXchelatase来提高藻类细胞的固碳效率，从而产生更多的有机物和大量的小球藻，最终导致更大的生物量。同时FBA和TK在微藻突变株中被下调，两者都促进了糖酵解过程并增强了PPP。增强的糖酵解过程导致脂肪酸和3-磷酸甘油的积累，从而产生大量的ATP。PPP的增强会产生大量的NADPH还原能力，从而为脂肪酸和3-磷酸甘油酯提供充足的氢供应。ATP的能量供应通过多步酰化作用促进了TAG的合成，进而促进了小球藻中脂质的积累。这些发现在蛋白质组学水平上为离子植入诱变促进小球藻突变株高脂质生产率提供了合理化的机制。