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百萤问号：荧光素酶到底该如何检测？

作者：西安百萤生物科技有限公司 2023-08-01T00:00 (访问量:7613)

如果您正在做一项实验，它需要检测荧光素酶，而这是您的第一次荧光素酶检测实验，您可能会有很多问题和假设。那么，究竟如何入门该实验，您又该注意哪些方面的问题？别着急，百萤为您一一解答。

1.什么是萤光素/萤光素酶反应?它如何起作用？

在自然界中，当化学能转化为光能时，就会发生生物发光。萤火虫，真菌和海洋生物等许多生物都出于多种原因出现生物发光。当萤光素酶催化萤光素的氧化导致发光时，就会发生该过程。反应机理如下图所示：

2.萤光素酶检测的主要目的是什么？

萤光素酶是检测启动子强度和活性的好方法。例如，如果您想研究启动子区域内的转录，可以将荧光素酶基因置于启动子后面。转录该基因后，您将根据产生的荧光强度知道自己是否具有强大的启动子。检测中产生更强的荧光意味着更多的荧光素酶被转录，这意味着您具有更强的启动子。您也可能会遇到的另一个问题是，如果要检测基因表达，何时选择荧光素酶测定法，何时选择qPCR。要记住的是：qPCR方法将测量基因的转录本。它不会告诉您转录的控制。但是，使用萤光素酶可以测量启动子的和转录调控。还要考虑的另一件事是，您想要研究基因调控的深度。您可能会发现，必须同时执行这两种技术才能了解项目的主要方面。

3.我需要什么进行荧光素酶检测？

领域

研究类型

试剂

仪器

孔板/管

生物光学成像

细胞、活体动物（如：小鼠）

荧光素酶检测试剂/荧光素酶检测试剂盒

酶标仪/单管发光仪

微孔板/微量离心管

注：

1.试剂：您可以选择一个试剂盒来进行实验，它会包含您需要的所有必要成分；您也可以选择试剂，再配制或购买其他实验中的必要成分。如果您购买的是单独的产品，那么我们建议您考虑质量，尤其是在荧光素方面。纯度的差异会产生影响。而试剂盒具有相当大的便利性，例如，您不必制作缓冲液，因为试剂盒中已经提供了它。制备萤光素储液时，无需称量，因为您的萤光素已经过测量。它还在您的实验设置中提供了统一性。

2.仪器：首先检查您的仪器是酶标仪还是单管发光仪，找出您的仪器是否带有进样器。并找出您的仪器在什么波长下工作以及在什么温度下工作。所有这些都将帮助您进一步规划实验。（酶标仪允许您读取孔板中的样品。通常范围在96到384之间；单管发光仪，将读取单个微量离心管。）

3.孔板/管：对于这种测定类型，必须使用平坦的底板（不要使用圆底的孔板）。它们是专门为光学检查和细胞培养应用而设计的。透明的孔板使您可以看到裂解物，但缺点是相邻的孔中的背景可能会影响您的观察。白色的孔板可以防止出现这种背景。但是，您看不到自己的裂解物。底部透明的白板可以解决可见性和背景问题，但价格昂贵。如何选择，取决于您的实验需求及资金。

4.萤光素酶检查的基本步骤是什么？

荧光素酶检查的步骤非常相似，您是进行双重报告基因分析还是单个报告基因。基本步骤如下：

a. 选择荧光素酶报道基因（萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶等）。如果要进行双重报告基因检测，则萤光素酶需要进行不同的光谱检查。

b. 将报告基因克隆到质粒中。如果您要进行双重报告基因检测，则将其他报告基因克隆到单独的质粒中。

c. 将质粒与实验细胞共转染。

d. 经过24至48小时培养后，取出培养基并裂解细胞。

e. 将包含萤光素的缓冲液添加到裂解物中，使用酶标仪进行检测。

这些是您可以遵循的一般步骤。实际情况应根据您要执行的分析类型和实验目标，调整实验方法。

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